腸炎沙門氏菌FliC蛋白對雞PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響研究.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis,SE)宿主范圍非常廣泛，除造成禽類發(fā)病以外，它還是重要的食源性病原體，能引起人的胃腸炎和食物中毒，具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。FliC蛋白是腸炎沙門氏菌重要的致病因子，引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。研究FliC蛋白對雞PBMCs分泌細(xì)胞因子的影響將為FliC蛋白的免疫佐劑功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增到了腸炎沙門氏菌fliC基因，將其連接到pET32a（

2、+）原核表達(dá)載體中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-fliC。表達(dá)的重組蛋白通過鎳離子親和層析和分子篩進(jìn)行純化，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析、定量和內(nèi)毒素測定，純化的FliC蛋白天然結(jié)構(gòu)的變化通過流式細(xì)胞儀檢測其與受體之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功擴(kuò)增到了長度為1518 bp的fliC全長基因，該基因編碼的蛋白在大腸桿菌中30℃下可以可溶性形式表達(dá)。經(jīng)過鎳離子親和層析與分子篩的純化方法獲得的FliC蛋白高度純化，其內(nèi)毒素的含量

3、低于0.5 EU/ml。該方法獲得的FliC蛋白能夠結(jié)合293T細(xì)胞上的受體，表明純化的FliC蛋白具有完整的天然結(jié)構(gòu)和生物活性。
　　分離雞外周血單個核細(xì)胞，分別用終濃度為20、10、5?g/mL的FliC蛋白刺激6和12 h，提取細(xì)胞RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用熒光定量PCR檢測IL-2、IFN-γ、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：FliC蛋白刺激6 h能促進(jìn)雞IL-2表達(dá)水平顯著提高；Fli

4、C蛋白刺激6 h能促進(jìn)IFN-γ表達(dá)量明顯增加，呈蛋白濃度依賴性，終濃度為20?g/mL，刺激6 h組，雞IFN-γ表達(dá)量最高；不同濃度的FliC蛋白均能促進(jìn)雞IL-8分泌，終濃度為20?g/mL的FliC蛋白刺激12 h，雞IL-8表達(dá)量最高；不同濃度的FliC蛋白均能促進(jìn)TNF-α表達(dá)，且5?g/mL刺激12 h時TNF-α表達(dá)量最高。
　　本研究利用原核表達(dá)純化的腸炎沙門氏菌FliC蛋白刺激雞外周血單個核細(xì)胞，對免疫相關(guān)細(xì)胞