外周血氧化型低密度脂蛋白特異性抗原的自身抗體與急性冠脈綜合征的相關性研究.pdf

1、目的：
　　急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes，ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵蝕，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的一組臨床綜合征，是冠心病的主要死亡原因。盡管許多ACS患者的臨床癥狀各異，但其冠狀動脈卻具有非常相似的病理生理改變，即冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉為不穩(wěn)定，繼而破裂導致血栓形成。然而，目前尚無有效的生物標志物對其早期診斷與識別。如何應用簡單易行的實驗方法，對不穩(wěn)定斑

2、塊尤其在斑塊破裂前進行早期識別及治療，將是對ACS甚至動脈粥樣硬化性疾病的最具重大意義的研究。
　　低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)在內皮下的滯留及其氧化修飾是觸發(fā)動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)，繼之引起炎癥細胞的浸潤和激活，并且促進巨噬細胞轉化為泡沫細胞。適應性免疫系統(tǒng)可在動脈粥樣硬化形成過程中被激活，通過特異性免疫反應不斷加重動脈粥樣硬化的病理變化過程。由于血中高濃度抗氧化物質的存在，導致循環(huán)

3、中的氧化型低密度脂蛋白（oxidativelow density lipoprotein, oxLDL）水平非常低，在健康個體中，估測血漿平均oxLDL濃度僅大約是0.1ng/μg LDL蛋白，直接測定血漿或血清中oxLDL水平有很高難度，并且可能與動脈硬化斑塊內oxLDL水平不完全一致。但是，修飾的LDL分子在氧化進程末期具有了趨化性、細胞毒性及免疫原性，能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對oxLDL的特異性抗體。這些抗體可在血清中檢測到。因此，

4、oxLDL的劑量僅僅反應了某一時刻的氧化狀態(tài)，可以受到很多因素的影響，而血清中的抗oxLDL抗體的出現(xiàn)表明了體內一個長期脂質過氧化反應的存在。
　　目前已經(jīng)證實，抗oxLDL的自身抗體幾乎能夠在所有個體中檢測到，其往往在臨床疾病發(fā)生前的早期就達到最高水平。目前已經(jīng)進行很多研究去確定抗oxLDL自身抗體與心血管疾病的相關性。然而，這些研究的結果并不一致，一些結果表明循環(huán)中抗oxLDL自身抗體水平與動脈粥樣硬化的嚴重性呈負相關，然而，

5、也有一些研究則表明相反的結論。對于這些結果的不一致性仍然不能完全解釋，可能由于LDL在體外也非常易被氧化修飾，導致在抗體檢測方法中很難標準化所使用的LDL抗原，尤其是很多研究測定的是抗原始的LDL的抗體水平。所以，其中一種克服oxLDL抗體檢測中標準化問題的方法，就是去測定針對特異性的原始的或MDA-修飾的apoB100肽鏈序列的自身抗體。
　　apoB100的蛋白水解和乙醛修飾的肽類片段是oxLDL的主要抗原成分。這些抗原因為有

6、獨特的氨基酸序列所以對oxLDL具有特異性。這些被MHC-Ⅱ呈遞的抗原一般為長度為13-17個氨基酸的序列，他們將與其他肽鏈序列的交叉反應的幾率降到最低，具有較好的特異性。成熟的apoB100蛋白是由4563個氨基酸組成的單一多肽鏈，而抗原表位序列多集中在頭端及尾端，已經(jīng)證實，其N端的1000個氨基酸與八目鰻卵黃生成素中的脂質結合口袋表現(xiàn)出了同源性，在LDL的形成中起到了非常重要的作用，在脂蛋白的形成過程中可以催化脂質向apoB的轉移。

7、
　　根據(jù)以上理論基礎，本研究利用生物信息學數(shù)據(jù)庫和在線工具，以中國人ox-LDL蛋白中apoB100的分子特性及表位特征，選擇apoB100蛋白N端的1000個氨基酸設計特異性多肽抗原序列，該抗原將覆蓋90％以上的中國漢族人主要組織相容復合體(人類MHC或HLA)遺傳背景。并應用相似的自行設計、優(yōu)化的ELISA方法檢測血清中的特異性抗體的水平。最終觀察外周血中此類抗體與ACS、冠脈斑塊穩(wěn)定型之間的相關性。目前國內外尚未見類似研究

8、。
　　方法：
　　1、本研究選擇中國漢族人群oxLDL蛋白中的apoB100分子，利用生物信息學數(shù)據(jù)庫及軟件綜合分析蛋白結構和性質，測試其PH值、柔性、親水性及抗原性等指標，在其N端的1000個氨基酸序列中共設計了4條多肽抗原片段;
　　2、利用自行設計并改良的ELISA方法，應用所設計的抗原多肽檢測外周血中自身IgG抗體水平，以特異性結合指數(shù)(special binding index，SBI)來判定抗原多肽與血清

9、自身抗體的結合程度。SBI=[人多肽抗原OD值-陰性對照OD]/[玉米抗原OD值-陰性對照OD]。
　　3、研究對象:所有冠心病、ACS及陳舊性心肌梗死（old myocardial infarction，OMI）患者均來源于2012年1月-2014年1月在中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心內科住院治療并確診的患者，急性心肌梗死診斷標準符合2012版第三次全球心肌梗死通用定義，不穩(wěn)定心絞痛診斷符合2012年中華醫(yī)學會心血管病分會頒布的《非

10、ST段抬高急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南》。冠心病及OMI患者診斷標準符合第七版《內科學》診斷。排除患有腫瘤、風濕免疫及結締組織病、器官移植，長期使用免疫抑制劑者。并取同年于我科體檢的未患心血管病人群作為對照組。最終入組冠心病100例，ACS組356例，OMI組100例，分別對應對照組100例、216例及100例。本研究由中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院倫理委員會同意并簽署知情同意書。
　　4、首先在冠心病患者中驗證由上述設計抗原可以檢

11、測到外周血IgG抗體的存在，并且與健康對照組之間進行比較。進一步在ACS患者中研究，對比基線資料，觀察此類抗體SBI水平在ACS組患者中的變化，并分析各抗體對ACS診斷的敏感性、特異性及診斷陽性預測值。
　　5、最后以冠脈病變Gensini評分及冠脈病變累計血管數(shù)量情況，分析以上4條抗體水平與冠脈病變的相關性，并進一步在穩(wěn)定的OMI患者中驗證以上抗體水平的變化，以分析以上4條自身IgG抗體水平與冠脈斑塊穩(wěn)定性之間的關系。
　

12、　6、統(tǒng)計分析采用非參數(shù)檢驗，所有統(tǒng)計應用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0(IBM，USA)，P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、線性多肽抗原的設計:根據(jù)抗原設計原則，在oxLDL分子的apoB100的前1000個氨基酸序列中，共設計4條多肽片段作為抗原，具體序列分別如下：
　　oxLDL-1:H-CDRFKPIRTGISPLALIKGMTRPLSTLIS-OH;
　　oxLDL-2:H-LQWLKRV

13、HANPLLIDVVTYLVALIPEPS-OH;
　　oxLDL-3:H-TFLDDASPGDKRLAAYLMLMRSPSQA-OH;
　　oxLDL-4:H-TVMDFRKFSRNYQLYKSVSLPSLDP-OH
　　2、自行設計的改良的ELISA抗體檢測方法同樣適用于對抗oxLDL IgG抗體的檢測，經(jīng)過對選擇的4條oxLDL多肽抗原及玉米抗原進行濃度梯度檢測，確定了其工作濃度為10μg/ml。經(jīng)過反復檢測，結

14、果穩(wěn)定，批間變異率達到質控要求。
　　4、在ACS患者中檢測上述4條抗原的IgG抗體水平，結果顯示:①ACS組中抗oxLDL-1與oxLDL-4的IgG抗體SBI值明顯高于對照組。在ACS亞組分析中顯示，抗oxLDL-1、oxLDL-4的IgG抗體在AMI及UA組均明顯高于對照組;而抗oxLDL-2抗體水平僅UA組升高，明顯高于AMI與對照組。OxLDL-3抗體在所有分析中均為陰性。②分析以上4條IgG抗體對ACS、AMI亞組及U

15、A亞組預測的ROC曲線，結果可見，抗oxLDL-1、oxLDL-2及oxLDL-4的IgG抗體均對ACS具有一定的診斷準確性;其中抗oxLDL-1及oxLDL-4的IgG抗體對AMI有一定的診斷準確性。而抗oxLDL-1和oxLDL-2的IgG抗體對UA有一定的診斷準確性。所有抗體在特異性90％左右時的敏感性均偏低。③進一步計算相應IgG抗體的陽性界值，得出抗oxLDL-1、oxLDL-2及oxLDL-4的IgG抗體對ACS診斷的陽性率

16、分別為15.5％、12％及15.4％，聯(lián)合預測的陽性率達31.6％;抗oxLDL-1及oxLDL-4的IgG抗體對AMI診斷的陽性率分別為15.6％與15.9％，兩者聯(lián)合診斷的陽性率30.6％;抗oxLDL-1與oxLDL-2的IgG抗體對UA診斷的陽性率分別為19.2％與16.7％，兩者聯(lián)合診斷的陽性率為35.9％。
　　結論：
　　1、利用生物信息學數(shù)據(jù)庫和在線工具，根據(jù)中國漢族人oxLDL蛋白中apoB100前1000

17、個氨基酸的結構分析，能夠設計出親水性、抗原性良好的多肽片段作為抗原。并且應用改良的ELISA方法能夠檢測出外周血中IgG抗體水平，結果穩(wěn)定。
　　2、目前所設計的4條oxLDL多肽抗原中，oxLDL-1、oxLDL-2與oxLDL-4的 IgG抗體水平在ACS組、AMI亞組或UA亞組均有不同程度的升高。ROC曲線分析以上抗體對ACS診斷具有一定的敏感性及特異性，存在明確的陽性預測價值，可能為疾病診斷提供理論依據(jù)。
　　3、進