濾泡輔助性T細(xì)胞參與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)白質(zhì)炎性脫髓鞘為病變特征的自身免疫性疾病,確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。傳統(tǒng)的免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞免疫在該病的發(fā)生中具有關(guān)鍵作用,但近年來B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫逐漸成為MS研究的熱點(diǎn),來自動物實(shí)驗(yàn)、尸檢研究、外周血和腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)細(xì)胞分析、以及臨床B

2、細(xì)胞去除治療的諸多證據(jù)均支持了B細(xì)胞免疫及抗體在MS發(fā)病中的重要作用,但在MS中B細(xì)胞是如何活化及其調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。新近研究表明,濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells,Tfh)是一群表型為CD4+CXCR5+的T細(xì)胞亞群,可輔助B細(xì)胞活化、增殖、分化并形成生發(fā)中心(germinal center,GC)。Tfh細(xì)胞作為B細(xì)胞活化的真正輔助者,其發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是T-B細(xì)胞協(xié)作研究的重大突破[1],疾病狀態(tài)

3、下Tfh細(xì)胞的功能變化已成為當(dāng)前相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)作為MS的經(jīng)典動物模型,Tfh細(xì)胞及與B細(xì)胞相互作用對該自身免疫性疾病的影響如何同樣有待深入探討。
　　目的：
　　建立并評估 EAE小鼠模型;觀察 EAE小鼠脾臟生發(fā)中心以及脊髓異位淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)的形成;探討Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞及其細(xì)胞亞群在不同病程時(shí)期EA

4、E小鼠外周免疫器官和病變靶器官中的比率變化,以期提供Tfh細(xì)胞參與EAE疾病過程的初步證據(jù)。
　　方法：
　　用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55（myelin oligodendroglia glycol protein,MOG35-55)多肽誘導(dǎo)C57BL/6小鼠,建立EAE動物模型;用蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色和勞克堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol fast blue,LFB)染色評估EAE發(fā)

5、病小鼠脊髓組織中的病理學(xué)改變;利用多重免疫熒光染色方法觀察EAE小鼠脾臟中生發(fā)中心的形成以及免疫細(xì)胞的位置變化,在脊髓組織中尋找異位淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu);借助流式細(xì)胞檢測方法觀察不同病程時(shí)期EAE小鼠脾臟、淋巴結(jié)及脊髓中Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞及其細(xì)胞亞群的比率變化,探討其與EAE疾病變化的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　MOG35-55多肽免疫小鼠最早于免疫后第11天開始起病,發(fā)病主要集中在免疫后第12-16天,于發(fā)病后4.25±0.74天達(dá)

6、到疾病高峰,總體發(fā)病率在90％左右?；疾⌒∈笾饕憩F(xiàn)為不同程度的肢體癱瘓,并以雙后肢為主。HE染色顯示在 EAE小鼠脊髓組織切片中有大量炎癥細(xì)胞浸潤,主要分布在血管周圍和脊膜處。LFB染色顯示在EAE小鼠脊髓炎性病灶內(nèi)可見多個(gè)髓鞘脫失區(qū)。多重免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)EAE小鼠脾臟中生發(fā)中心形成并伴有T細(xì)胞、B細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞(follicular dendritic cells,FDC)的位置變化;在EAE小鼠脊髓組織中發(fā)現(xiàn)了異位的淋巴濾泡

7、樣結(jié)構(gòu)。與此同時(shí),我們在EAE小鼠脾臟和脊髓組織中觀察到了大量的CD4+CXCR5+ICOS+和CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,在EAE發(fā)病前期、高峰期、緩解期以及慢性持續(xù)期小鼠脾臟、淋巴結(jié)和脊髓組織中 Tfh細(xì)胞比率均顯著增高,與正常對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中尤以疾病高峰期的升高幅度最大。Tfh細(xì)胞亞型分析顯示,在EAE小鼠病程中,Th1樣Tfh細(xì)胞比率下降,而Th2樣、Th17樣Tfh

8、細(xì)胞比率升高。與Tfh細(xì)胞變化趨勢相似,在EAE病程的對應(yīng)時(shí)間點(diǎn),患病小鼠脾臟、淋巴結(jié)以及脊髓組織中的B細(xì)胞亞型均較正常對照組顯著升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：EAE導(dǎo)致了小鼠脾臟中生發(fā)中心的形成,同時(shí)伴隨不同類型免疫細(xì)胞的位置遷移,并在 EAE病變靶器官脊髓組織中形成了異位的淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu),且 EAE不同病程時(shí)期小鼠外周免疫器官和病變靶器官中Tfh細(xì)胞及B細(xì)胞亞型比率始終處于較高水平,這些結(jié)果為Tfh細(xì)胞參與EAE疾病過程提