β-連環(huán)蛋白在TNF-Α和Fas誘導急性肝損傷中的雙重作用機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 急性肝功能衰竭是一種常見的臨床危重癥，常導致多器官功能衰竭，在全世界范圍內有極高的致死率。臨床上對于急性肝損傷的治療缺乏特異性治療手段，預后不理想。盡管原位肝移植是目前治療急性肝損傷的最有效手段，但是由于供肝來源短缺、手術風險高、費用昂貴，且術后需長期服用免疫抑制劑，也導致大部分患者無法接受肝移植治療。
　　 急性肝衰竭的發(fā)生機制主要包括毒性物質直接損傷細胞器引發(fā)細胞凋亡導致原發(fā)性肝損傷，以及肝毒

2、性物質刺激免疫系統(tǒng)活化引起繼發(fā)性肝損傷。因此，通過減輕細胞凋亡可作為治療急性肝損傷的新途徑。脂多糖(LPS)和D-半乳糖胺(GalN)聯(lián)合使用廣泛用于誘發(fā)小鼠急性肝損傷模型。TNF-α是在GalN/LPS模型中導致肝細胞凋亡的最重要因子。Fas誘導的肝細胞凋亡在免疫介導的肝臟疾病中起重要作用， Fas抗原在肝細胞內高表達，因而肝細胞對Fas誘導的肝損傷十分敏感。給予小鼠注射抗Fas抗體(Jo2)會產生致死性肝損傷。
　　 β-連

3、環(huán)蛋白(β-Catenin)是經典Wnt信號通路中的關鍵蛋白，調節(jié)調節(jié)細胞的生長、增殖、分化以及凋亡。Wnt/β-Catenin信號通路的異常改變，尤其是β-Catenin的持續(xù)活化在多種腫瘤中都有發(fā)生，包括原發(fā)性肝癌。β-Catenin對細胞凋亡的調節(jié)作用十分復雜，在本研究室前期工作中發(fā)現(xiàn)，肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠對GalN/LPS誘導的肝損傷敏感性降低，而對Jo2誘導的肝損傷反應加重。β-Catenin在兩種肝毒性藥物

4、誘導肝損傷過程中發(fā)揮雙重作用的機制還不清楚。
　　 本課題研究將利用肝細胞特異性β-Catenin敲除小鼠以及過表達β-Catenin的Hepa1-6細胞系從體內外兩方面對β-Catenin在急性肝損傷中的作用進行再一步驗證，并探討其發(fā)揮雙重作用的機制。
　　 材料和方法:
　　 1.繁育肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠，小鼠的基因表型通過PCR驗證;
　　 2.分別通過腹腔注射GalN/LPS和J

5、o2，建立小鼠肝損傷模型，處理6hr后收集肝臟標本;
　　 3.使用TUNEL法檢測肝細胞凋亡，Western blot檢測肝細胞凋亡相關蛋白PARP和Caspase3;
　　 4.應用si-RNA技術沉默Hepa1-6細胞中β-Catenin表達，沉默效率通過qRT-PCR和western blot檢測。應用CCK-8檢測沉默β-Catenin后細胞對TNF-α和Jo2的細胞毒性作用;
　　 5.應用免疫組化方

6、法檢測肝組織p65核轉位，報告基因檢測Hepa1-6細胞中NF-κB轉錄活性;
　　 6.應用qRT-PCR方法檢測NF-κB下游靶基因SOD2和A20表達;
　　 7.應用免疫共沉淀方法檢測β-Catenin和p65結合程度;
　　 8.含突變β-Catenin的腺病毒S37A用于感染Hepa1-6細胞，建立過表達β-Catenin的Hepa1-6細胞。過表達效率通過western blot，報告基因和qRT-

7、PCR檢測;
　　 9.細胞免疫熒光檢測過表達β-Catenin后p65核轉位情況;
　　 10.應用MDA試劑盒檢測過表達β-Catenin后Hepa1-6對TNF-α誘導的氧化應激的作用;
　　 11.qRT-PCR和Western blot檢測肝組織中Fas的表達情況。
　　 12.應用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計分析。
　　 結果:
　　 1.肝細胞特異

8、性敲除β-Catenin減輕GalN/LPS誘導的肝細胞凋亡。Hepa1-6細胞干擾β-Catenin表達后TNF-α誘導的肝細胞死亡減少，而過表達β-Catenin后肝細胞死亡增多。
　　 2.β-Catenin通過與NF-κB結合，影響NF-κB的轉錄活性。受GalN/LPS刺激后，肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠肝細胞中p65入核增加，下游靶基因A20和SOD2表達增加。Hepa1-6細胞過表達β-Catenin后p

9、65入核減少。
　　 3.肝細胞特異性敲除β-Catenin通過NF-κB加重GalN/LPS誘導的氧化應激反應。Hepa1-6細胞過表達β-Catenin后TNF-α誘導的氧化應激減弱。
　　 4.β-Catenin與NF-κB結合影響Fas表達。肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠肝細胞Fas表達增加，肝臟對Jo2刺激的敏感性增加，肝損傷加重，細胞凋亡增加。
　　 結論:
　　 本研究從動物和細胞水

10、平證明β-Catenin在TNF-α和Fas所致的急性肝損傷中起不同作用。β-Catenin能夠加重由TNF-α誘導的肝細胞凋亡，這主要是通過β-Catenin同NF-κB結合，抑制了其轉錄活性所致。此外，β-Catenin還可加重TNF-α誘導的氧化應激。由于Fas的表達也受NF-κB調控，肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠Fas表達增高，因而加重了Jo2誘導的肝損傷。β-Catenin通過與NF-κB的相互作用調節(jié)TNF-α和F