PCB153對(duì)PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)酶表達(dá)的影響.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）是一類新發(fā)現(xiàn)的潛在的持久性有機(jī)污染物（POPs），作為阻燃劑被廣泛用于電子產(chǎn)品、紡織品、建筑材料以及塑料制品等中。它具有高脂溶性、化學(xué)穩(wěn)定性、低降解性以及低揮發(fā)性等特性，可通過(guò)物理性滲漏和化學(xué)性結(jié)合作用使其在環(huán)境中蓄積。環(huán)境流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBDEs 廣泛存在于環(huán)境介質(zhì)（如空氣、水、土壤以及底泥），動(dòng)物體內(nèi)（魚(yú)體、巨鯨及鳥(niǎo)類）和人體（乳液、血液及脂肪組織）等中，對(duì)環(huán)境及人體健康構(gòu)成潛在的危害。 體內(nèi)

2、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PBDEs具有肝臟毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾以及致癌等多種毒作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暴露PBDEs 可引起成年期腦功能異常，主要表現(xiàn)為自發(fā)行為紊亂和學(xué)習(xí)記憶功能缺陷等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。何衛(wèi)紅等研究表明，四溴聯(lián)苯醚（PBDE-47）可致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激、微核形成和DNA 損傷等毒性效應(yīng)。Reistad等學(xué)者進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五溴聯(lián)苯醚（2,2’,4,4,6’-tetrabromodi

3、phenyl ether）和PBDE-47可誘導(dǎo)人粒性白細(xì)胞活性氧水平的增加，并且呈劑量依賴關(guān)系。Kodavanti等研究表明，PBDEs 可導(dǎo)致蛋白激酶C（PKC）易位和鈣穩(wěn)態(tài)失衡，而這可能是活性氧（ROS）形成的機(jī)制。PBDE-47 是生物樣本和人體材料中含量最高的PBDEs 同系物之一。因此，檢測(cè)PBDE-47 誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧以及由其所誘導(dǎo)的DNA 損傷之間的關(guān)系就是本文的研究目的之一。多氯聯(lián)苯（PCBs）是一種研究較深入的典型

4、持久性有機(jī)污染物，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為“人類可能的致癌物質(zhì)”和“動(dòng)物已知的致癌物質(zhì)”。雖然環(huán)境中的PCBs 有下降的趨勢(shì)，但還是處于一個(gè)相對(duì)較高的水平，故仍然是一種重要的不容忽視的持久性有機(jī)污染物。有研究表明PCBs 亦可致細(xì)胞氧化應(yīng)激和微核形成等DNA 損傷效應(yīng)。更值得注意的是，流行病學(xué)調(diào)查資料證實(shí)，PBDEs和PCBs 在多種環(huán)境介質(zhì)中共存，在人體乳液、血液以及脂肪組織中也檢出了兩者的同時(shí)存在，并且二者具有相似的毒性終點(diǎn)。因此考

5、慮當(dāng)這兩種物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)對(duì)DNA 損傷是否具有存在聯(lián)合作用？為了回答這一問(wèn)題，分別選取PBDEs和PCBs 在生物樣本及人體材料中含量最高的同系物之一的PBDE-47和2,2’,4,4’,5,’-hexachlorobiphenyl（PCB153）作為受試物，首次選用ROS、DNA 鏈斷裂和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）等指標(biāo)對(duì)二者的聯(lián)合作用進(jìn)行了研究。 DNA 修復(fù)系統(tǒng)在維持DNA 分子結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性、保持細(xì)胞的存活和正

6、常的生理活動(dòng)等方面都具有重要的意義。如果DNA 修復(fù)系統(tǒng)功能缺陷或喪失，則勢(shì)必會(huì)造成受損的DNA 不能被有效修復(fù)從而誘發(fā)突變，使基因組的不穩(wěn)定性增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。DNA 修復(fù)酶會(huì)根據(jù)DNA 損傷的程度和類型發(fā)生相應(yīng)的變化，故可根據(jù)DNA 修復(fù)酶的變化來(lái)間接的判斷DNA 損傷情況。XRCC1（X 線修復(fù)交叉互補(bǔ)組1）是影響細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感性的第一個(gè)哺乳類動(dòng)物基因，在DNA 單鏈損傷修復(fù)中起主要作用。它主要通過(guò)與多聚ADP 核

7、糖聚合酶（PARP）、DNA 連接酶III和DNA 聚合酶β相互作用，來(lái)修復(fù)包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種損害引起的DNA 損傷。XRCC3（X 線修復(fù)交叉互補(bǔ)組3）主要是通過(guò)核苷酸切除修復(fù)途徑對(duì)DNA 雙鏈斷裂進(jìn)行同源重組修復(fù)。基于上述理由，本實(shí)驗(yàn)選用主要針對(duì)DNA 單鏈斷裂修復(fù)的XRCC1基因和主要針對(duì)DNA 雙鏈斷裂修復(fù)的XRCC3基因，通過(guò)對(duì)其mRNA 水平的測(cè)定，進(jìn)一步闡明PBDE-47和/或PCB153 對(duì)DNA 損傷的影響，為研究

8、PBDE-47的毒作用機(jī)制以及和PCB153的聯(lián)合作用方式提供理論依據(jù)。本論文由兩部分組成： 第一部分、PBDE-47 與PCB153 單獨(dú)和聯(lián)合染毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA 損傷作用的影響 目的:探討PBDE-47 與PCB153 單獨(dú)和聯(lián)合染毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA 損傷的影響。 方法:體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞暴露于1、5、10 μM PBDE-47（低、中、高劑量組）單獨(dú)染毒組

9、和與5 μM PCB153 聯(lián)合染毒組以及100 μM 抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）組，以DMSO為溶劑對(duì)照，染毒24 h 后分別采用熒光染料DCFH-DA 標(biāo)記法，單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)和高效液相色譜-電化學(xué)技術(shù)（HPLC-ECD）分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、DNA 鏈斷裂和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）的含量。 結(jié)果:中、高聯(lián)合染毒組ROS 水平與對(duì)照組相比顯著增加，并顯著高于相應(yīng)的單獨(dú)劑量染毒組，加入抗氧

10、化劑后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平與PBDE-47 染毒劑量呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；中、高劑量PBDE-47 單獨(dú)染毒組和聯(lián)合染毒組細(xì)胞尾部DNA 百分率、Olive 尾距均顯著高于對(duì)照組，且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系；中、高聯(lián)合染毒組細(xì)胞尾部DNA 百分率顯著高于相應(yīng)的PBDE-47 或PCB153 單獨(dú)染毒組，中劑量PBDE-47與PCB153 聯(lián)合染毒組Olive 尾距顯著高于相應(yīng)的PBDE-47 或PCB153 單獨(dú)染

11、毒組，加入抗氧化劑后其細(xì)胞尾部DNA百分率及Olive 尾距均顯著下降；高劑量PBDE-47 單獨(dú)染毒組和中、高劑量聯(lián)合染毒組8-OHdG的含量與對(duì)照組相比均有明顯的增加，中、高劑量聯(lián)合染毒組8-OHdG 含量均明顯高于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組，加入抗氧化劑后其細(xì)胞內(nèi)8-OHdG 含量明顯下降。相關(guān)分析結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平與8-OHdG 含量、尾部DNA 百分率及Olive 尾距呈正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)分別為0.895、0.886、0.8

12、36）。 結(jié)論:一定劑量的PBDE-47 可致DNA 損傷，PCB153 可增強(qiáng)PBDE-47 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞DNA的損傷作用，氧化應(yīng)激可能在PBDE-47 致DNA 損傷方面發(fā)揮了重要作用。 第二部分、PBDE-47 與PCB153 單獨(dú)和聯(lián)合染毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞DNA 修復(fù)酶表達(dá)的影響 目的:研究PBDE-47 與PCB153 單獨(dú)和聯(lián)合染毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞DNA 修復(fù)酶XRCC1 mRNA和X

13、RCC3 mRNA 表達(dá)的影響。 方法:按第一部分的劑量分組和染毒方法對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞染毒24 h 后，用熒光定量PCR 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA 修復(fù)酶XRCC1和XRCC3 mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果:高劑量PBDE-47 單獨(dú)染毒組及中、高劑量聯(lián)合染毒組XRCC1 mRNA 表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯下降；高劑量單獨(dú)染毒組與低劑量單獨(dú)染毒組相比，XRCC1 mRNA的表達(dá)明顯下降；加入抗氧化劑后其XRCC1 mRNA 表達(dá)

14、明顯上升。高劑量PBDE-47 單獨(dú)染毒組和高劑量聯(lián)合染毒組XRCC3 mRNA 表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯上升，加入抗氧化劑后XRCC3 mRNA的表達(dá)明顯下降。相關(guān)分析結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平與XRCC1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.83），與XRCC3 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.42）。細(xì)胞DNA Olive尾距與XRCC1 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與XRCC3 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.