日本沼蝦亞硝酸鹽抗性相關(guān)基因的篩選與鑒定.pdf

1、日本沼蝦(Macrobrachium nipponinse)，俗名青蝦，自然分布于中國(guó)、日本、越南以及緬甸等地區(qū)，廣泛分布于我國(guó)各地淡水水域。是我國(guó)最重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類之一。在養(yǎng)殖水體中，亞硝酸鹽含量是影響日本沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的最重要的水質(zhì)指標(biāo)之一，研究和揭示日本沼蝦抵抗亞硝酸鹽脅迫的分子機(jī)制，可以為培育抗逆性強(qiáng)的個(gè)體奠定基礎(chǔ)；為日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，尤其是提高養(yǎng)殖成活率提供重要依據(jù)。
　　近幾年，Illumina高通量測(cè)序技術(shù)成為各

2、物種轉(zhuǎn)錄組分析鑒定的有力工具，在蝦類研究中，與低氧脅迫相關(guān)的高通量測(cè)序已有報(bào)道，但與亞硝酸鹽相關(guān)的基于Illunina平臺(tái)測(cè)序方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將日本沼蝦飼養(yǎng)于亞硝酸鹽濃度為10mg/L(96 LC-50)的環(huán)境下，48h時(shí)提取其肝胰腺，并與正常飼養(yǎng)條件下蝦的肝胰腺為對(duì)照，進(jìn)行高通量測(cè)序和比對(duì)檢測(cè)。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）10mg/L濃度的亞硝酸鹽脅迫48h后，日本沼蝦肝胰腺與對(duì)照組沼蝦的肝胰腺高通量測(cè)序結(jié)果顯示，

3、經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制，共得到34.68Gb Clean Data，各樣品Q30堿基百分比均不小于86.33％，各樣品Clean Data均達(dá)到5.37Gb，De novo組裝后共獲得56，054條Unigene。其中長(zhǎng)度在1kb以上的Unigene有14，373條。對(duì)Unigene進(jìn)行功能注釋，包括與 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，共獲得19，022條Unigene的注釋結(jié)果。進(jìn)行基因在各

4、樣品中的表達(dá)量分析。基于基因在不同樣品中的表達(dá)量，識(shí)別差異表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行模式聚類、功能注釋以及富集性分析。
　?。?）選擇15個(gè)差異表達(dá)的unigenes，用qRT-PCR驗(yàn)證了在脅迫組和正常組中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，熒光定量檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)相一致。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選取與免疫相關(guān)的影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能研究。
　?。?）選取Guaninenucleotide-

5、binding protein和Lysosome兩種關(guān)鍵基因，分別檢測(cè)了其肝胰腺在亞硝酸鹽脅迫下不同時(shí)間段(4h，10h，24h，48h，72h，96h)的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示 Lysosome基因在4h時(shí)出現(xiàn)表達(dá)，10h時(shí)表達(dá)量最高。Guaninenucleotide-binding protein基因在10h和48h時(shí)表達(dá)量均達(dá)到峰值。這兩種基因在48h時(shí)的肝胰腺、鰓和肌肉三種組織中有不同的表達(dá)量，其都在肌肉中的表達(dá)量最高，兩種

6、基因在對(duì)抗亞硝酸鹽脅迫時(shí)在肌肉組織中的表達(dá)最為活躍。
　?。?）對(duì)正常飼養(yǎng)條件下的日本沼蝦和亞硝酸鹽脅迫下的肝胰腺進(jìn)行組織學(xué)比較，電鏡觀察結(jié)果顯示，隨著亞硝酸鹽脅迫時(shí)間的增加，肝胰腺細(xì)胞逐漸出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，管壁細(xì)胞與基膜分離，嚴(yán)重時(shí)管壁破裂，這說(shuō)明亞硝酸鹽脅迫會(huì)損傷或破壞肝胰腺的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而會(huì)影響肝胰腺的生理功能，影響動(dòng)物體內(nèi)酶的催化作用和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而破壞滲透壓的平衡。脅迫48h時(shí)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體顆粒開(kāi)始大量脫落，內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重水腫，線粒體內(nèi)部局部瓦解，線粒體雙層膜溶解，出現(xiàn)電子透明區(qū)，部分趨于解體；微絨毛變形和少數(shù)破損，表明久效亞硝酸鹽對(duì)肝胰臟已構(gòu)成了較大的損傷和破壞，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞器的損傷越來(lái)越嚴(yán)重。
　　綜上所述，本研究對(duì)日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，獲得了大量的轉(zhuǎn)錄組信息，為日本沼蝦的轉(zhuǎn)錄組研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。選擇一些關(guān)鍵基因，得到了其在各組織中的差異表達(dá)情況，進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了研究，推測(cè)出在抗亞硝酸鹽脅迫中的關(guān)鍵基因，研究