胃癌中Fascin基因的表達(dá)及與進(jìn)展期胃癌預(yù)后相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、第一部分 Fascin基因在胃癌中的表達(dá)及其意義 目的：Fascin蛋白代表一類肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族，其蛋白質(zhì)編碼的產(chǎn)物是一種細(xì)胞骨架蛋白。這種蛋白可以與F-肌動(dòng)蛋白相結(jié)合，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶（ruffles）邊緣的絲狀偽足、微棘（microspikes）等細(xì)胞突起的核心肌動(dòng)蛋白束，通過(guò)與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，可以完成細(xì)胞的附著和運(yùn)動(dòng)。這種結(jié)構(gòu)的形成受細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在正常人上皮細(xì)胞中，在

2、食道鱗狀上皮基底層和表皮基底層中均有表達(dá)，而在其他的上皮組織沒(méi)有表達(dá)。在對(duì)于腫瘤組織上皮研究中發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥上皮細(xì)胞中，F(xiàn)ascin呈陽(yáng)性表達(dá)，且在部分腫瘤中與腫瘤的預(yù)后有一定關(guān)系。在對(duì)于Fascin在消化道腫瘤中表達(dá)的研究，目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化方法研究Fascin蛋白在249例胃癌病人腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)合腫瘤病人的臨床病理學(xué)特征，綜合分析不同類型腫瘤細(xì)胞的臨床病理特征與Fascin表達(dá)之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)Fascin在

3、胃癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。 研究方法：采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)北京大學(xué)臨床腫瘤醫(yī)院自1996～2001年間手術(shù)切除的胃癌手術(shù)標(biāo)本249例行Fascin免疫組化染色，研究Fascin在胃癌病人的表達(dá)。同時(shí)收集這些病例的臨床資料，包括病人的年齡、性別、胃癌的分期、腫瘤的TNM分期、腫瘤細(xì)胞的分化。對(duì)病人的術(shù)后生存進(jìn)行隨訪觀察。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SSPS13.0，分析所得到的臨床病理數(shù)據(jù)和Fascin的表達(dá)水平的關(guān)系。 結(jié)果：24

4、9例病人中，55例病人腫瘤細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)（22.1％），其中37例表達(dá)為“1+”（14.9％），18例病人腫瘤細(xì)胞表達(dá)為“2+”（7.2％）。通過(guò)對(duì)Fascin的表達(dá)與臨床病理學(xué)資料的研究，我們發(fā)現(xiàn)Fascin的表達(dá)與病人的年齡（p=0.032）、胃癌細(xì)胞的分化程度相關(guān)，其中，在高分化的胃癌腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)ascin的表達(dá)與低分化的腫瘤細(xì)胞相比較有顯著性差異（p=0.001）。而在性別、腫瘤的T、N、M分期方面，F(xiàn)ascin的表達(dá)無(wú)明顯差

5、異。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在Fascin表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（2+）的病人中，其預(yù)后要明顯差于陰性表達(dá)的病人。 結(jié)論: 1.Fascin在正常胃腺上皮中無(wú)表達(dá)，在胃癌中有表達(dá)，胃癌中Fascin的表達(dá)，提示胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)骨架發(fā)生改變。 2.Fascin在分化不同的胃癌中表達(dá)有差異，提示胃癌的分化與其表達(dá)強(qiáng)度不同與存在一定關(guān)系。 3.Fascin在胃癌病人中的高表達(dá)提示預(yù)后不良。 第二部分與進(jìn)展期胃癌預(yù)后相關(guān)的蛋

6、白組學(xué)研究 研究目的:胃癌是危害我國(guó)人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康。雖然早期胃癌治療目前的五年生存率可以達(dá)到85％以上，但在我國(guó)這部分病人的比例僅僅占到10％-30％。在就診的胃癌病例中，絕大部分為進(jìn)展期胃癌，其整體治療效果不好，預(yù)后差異較大。因此術(shù)前通過(guò)尋找合適的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于術(shù)前準(zhǔn)確的病理分期（TNM）、提供針對(duì)性措施的治療、判斷進(jìn)展期胃癌病人的預(yù)后等方面有深遠(yuǎn)的意義。

7、腫瘤標(biāo)志物，是惡性腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成、分泌的，或因機(jī)體對(duì)腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生的、反應(yīng)腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，是檢測(cè)、診斷、治療、監(jiān)測(cè)腫瘤和判斷腫瘤預(yù)后的重要標(biāo)志。目前臨床上常用的胃癌腫瘤標(biāo)志物有CEA，CA19-9等，由于缺乏一定的特異性和敏感性，主要用于胃癌病人的初篩和治療后的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。目前臨床工作中，缺少反映進(jìn)展期胃癌預(yù)后相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。 蛋白組學(xué)（protemics）是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，

8、分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化蛋白質(zhì)的組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律。同時(shí)質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展和二維電泳技術(shù)的不斷進(jìn)步，為蛋白質(zhì)組研究進(jìn)行高靈敏度、高速鑒定提供了有力支持，為分析體液中各種復(fù)雜蛋白質(zhì)成分提供了可能。用蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)研究腫瘤，有利于篩選腫瘤標(biāo)志蛋白，判斷腫瘤的預(yù)后，確定腫瘤治療靶標(biāo)，尋找新的腫瘤特異抗原。 通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究不同預(yù)后的進(jìn)展期胃癌病人之間

9、蛋白表達(dá)的差異，可以幫助我們發(fā)現(xiàn)一系列的反應(yīng)不同預(yù)后的進(jìn)展期胃癌病人的蛋白表達(dá)，通過(guò)這些蛋白質(zhì)的篩選和進(jìn)一步研究，以期發(fā)現(xiàn)能夠反應(yīng)進(jìn)展期胃癌病人預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，通過(guò)這些標(biāo)志物，可以對(duì)胃癌的分期做出準(zhǔn)確判斷，可以推測(cè)胃癌病人的預(yù)后，以及尋找胃癌藥物靶向治療的新思路。 研究方法:為了鑒定與進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后相關(guān)的蛋白，我們回顧性選取了預(yù)后相差較大的兩組進(jìn)展期胃癌患者的冰凍組織為研究對(duì)象（預(yù)后好的一組患者的生存期均>34個(gè)月，預(yù)后差

10、一組患者的生存期均<15個(gè)月）。分別提取兩組的組織蛋白經(jīng)等量混合、胰酶消化過(guò)夜后，應(yīng)用NanoLC-MS/MS（LTQ）（納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，線性離子阱）方法得到兩組差異蛋白的氨基酸序列，數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot服務(wù)器及Swiss-prot、NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了常規(guī)序列相似性分析及蛋白的鑒定。 針對(duì)兩組間表達(dá)差異較大的基因S100P和HnRNP A2/B1，我們采用了免疫組化方法對(duì)93例進(jìn)展期胃癌病人的標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，

11、同時(shí)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了分析。 研究結(jié)果:應(yīng)用蛋白質(zhì)組的方法，在預(yù)后好的組中共鑒別出284個(gè)蛋白，在預(yù)后差的組中鑒別出213個(gè)蛋白，其中，130個(gè)蛋白只在預(yù)后好的一組被識(shí)別，58個(gè)蛋白只在預(yù)后差的一組被識(shí)別。其中在兩組間均鑒別出且差異大于3倍的有14個(gè)，大于兩倍的有28個(gè)。對(duì)于兩組中分別鑒別出的蛋白，應(yīng)用WEGO在線工具，對(duì)其基因功能進(jìn)行了分類，這些蛋白涉及鈣離子的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞代

12、謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架蛋白等等，為進(jìn)一步尋找可以預(yù)測(cè)進(jìn)展期胃癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。這些蛋白中，有些已經(jīng)被文獻(xiàn)證實(shí)與胃癌的預(yù)后或轉(zhuǎn)移等相關(guān)。 通過(guò)對(duì)16例預(yù)后不同的進(jìn)展期胃癌病人的臨床病理學(xué)資料進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，在不同預(yù)后的進(jìn)展期胃癌病人中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在N1和超過(guò)N1轉(zhuǎn)移的兩組中，其差異具有顯著性。我們期望通過(guò)差異蛋白組學(xué)的研究，篩選出能夠預(yù)測(cè)進(jìn)展期胃癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的腫瘤標(biāo)志物，針對(duì)兩組間表達(dá)差異較大的基因S1

13、00P和HnRNP A2/B1，我們采用了免疫組化方法進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)對(duì)其在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了描述，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100P在正常胃粘膜中表達(dá)較高，在胃癌中的表達(dá)下降，在本組的93例病例中其陽(yáng)性表達(dá)率為47.3％，并且其在胃癌中的高表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)（P=0.0375），S100P在胃癌中的高表達(dá)與原發(fā)腫瘤的浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)（P＝0.006，P=0.006）。研究表明，免疫組化和蛋白質(zhì)組學(xué)的分析鑒

14、定結(jié)果是一致的，S100P可以用來(lái)作為判斷進(jìn)展期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。而在HnRNPA2/B1的免疫組化中發(fā)現(xiàn)，其在胃癌組織中的表達(dá)為92.6％，而在癌旁的非腫瘤組織中，也發(fā)現(xiàn)了其陽(yáng)性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HnRNP A2/B1的表達(dá)與病人的臨床病理學(xué)資料中差異無(wú)顯著性意義，表明其并不適合作為判斷進(jìn)展期胃癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。 結(jié)論: 1.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，可以在不同預(yù)后的進(jìn)展期胃癌病人篩選出差異表達(dá)的蛋白

15、，這些蛋白涉及鈣離子的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架蛋白等等，可以為鑒定胃癌病人的分期、預(yù)后相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物研究提供基礎(chǔ)。 2.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（超過(guò)第一站的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）是影響進(jìn)展期胃癌病人預(yù)后的一個(gè)關(guān)鍵因素。 3.S100P可以反應(yīng)進(jìn)展期胃癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，從而可以作為腫瘤標(biāo)志物用來(lái)判斷進(jìn)展期胃癌病人的預(yù)后。 4.HnRNP A2/B1不適合用于判斷進(jìn)展期胃癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。 5.進(jìn)展期胃