人B7-2瘤苗與DC瘤苗的制備及其體外聯(lián)合誘導抗食管癌的免疫作用.pdf

1、授予單位代碼學號或申請?zhí)柮芗夃嵵荽髮W碩士學位論文論文題目作者姓名學科門類專業(yè)名稱導師姓名、職稱10459020819人B7—2瘤苗與DC瘤苗的制備及其體外聯(lián)合誘導抗食管癌的免疫作用路靜醫(yī)學病理學與病理生理學董子明教授二零零五年五月十六日鄭州犬學2005屆碩士學位論文人B72瘤苗與DC瘸苗的制備放其體外聯(lián)臺誘導抗食管癌的免疫作用應用逆轉錄PCR、巢式PCR的方法從重癥胍無力患者胸腺組織中擴增B7—2cDNA基因片段，經(jīng)同收、純化、酶切鑒定

2、后，依次連接到質(zhì)粒pOEM—T和pEGFPN3上。2人B72瘤苗的制各應用脂質(zhì)體轉染技術，將重組質(zhì)粒pEGFPN3。B72轉染EC9706，24h后在熒光倒置顯微鏡下觀察融合基因的表達情況。G418加壓篩選30d，獲得穩(wěn)定表達融合基因的EC9706細胞，RTPCR檢測B72基因的表達。3人DC瘤苗的制備31采用反復凍融法制備人食管癌細胞EC9706抗原32臍血單個核細胞(MNC)的分離及DC、T細胞的誘導采用密度梯度離心法從臍血中分離M

3、NC后，加入含15％自體血漿的RPMll640培養(yǎng)基懸浮細胞接種入24孑L板，37。C5％C02孵箱培養(yǎng)2h后，輕輕吸出上清置培養(yǎng)瓶中獲得T淋巴細胞，加入因子rhlL2(Sng／m1)繼續(xù)培養(yǎng)。24孔板中貼壁細胞為單核細胞，加入細胞因子rhGMCSF(10ng／m1)、rhIL4(10ng／m1)誘導分化，第3d加入EC9706的凍融抗原，第6d加入LPS(5pg／m1)，第7d收獲負載腫瘤抗原的成熟樹突狀細胞。33DC激活自體T淋巴細

4、施為CTL取腫瘤相關抗原(TAA)致敏的成熟DC與T淋巴細胞以1：20比例混合，共培養(yǎng)3d。DC遞呈抗原并激活幼稚T淋巴細胞，促使T淋巴細胞活化為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。4MTT法檢測B72瘤苗與DC瘤苗體外聯(lián)合抗食管癌細胞效應致敏的T細胞(CTL)為效應細胞，穩(wěn)定轉染pEGFPN3的EC9706、穩(wěn)定轉染pEGFPN3B7—2的EC9706、未轉染的EC9706為靶細胞，效靶比為30：1，分組進行混合培養(yǎng)72h，MTT法檢測T淋