血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)產(chǎn)生SDF-1α促進移植物動脈硬化.pdf

1、目的:移植物動脈硬化是以彌漫性內(nèi)膜增生為特征的慢性血管增殖性疾病,也是導(dǎo)致遠期移植器官功能喪失、限制其遠期療效的主要原因。移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡是器官移植后的早期事件,有研究提示移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡可能通過募集骨髓間充質(zhì)干細胞參與移植物動脈硬化。本研究擬探討移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡對移植物動脈硬化的促進作用及其分子機制。方法:原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動子的野生型 p53基因慢病毒載體,

2、采用DAPI細胞核染色和流式細胞術(shù)檢測過表達 p53對血管平滑肌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用,采用Western blot和ELISA分析檢測觀察血管平滑肌細胞凋亡對細胞因子 SDF-1α,TGF-β和PDGF-BB表達的影響。體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,制備 p53過表達血管平滑肌細胞條件培養(yǎng)液,采用Transwell細胞遷移分析和BrdU標(biāo)記法檢測血管平滑肌細胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的影響;并應(yīng)用選擇性細胞信號阻斷劑對骨髓間充質(zhì)干

3、細胞進行預(yù)處理,以探討血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的分子機制。建立大鼠主動脈移植模型,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動子的BclxL基因慢病毒載體,采用TUNEL分析檢測移植動脈中膜平滑肌細胞凋亡情況;采用免疫組化染色檢測移植動脈壁中SDF-1α的蛋白水平;采用HE和Masson染色進行組織病理學(xué)分析,探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對移植動脈新生內(nèi)膜形成的影響;并應(yīng)用免疫雙熒光染色探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞

4、參與內(nèi)膜增生的影響。同時,建立異系大鼠主動脈移植模型,對受體大鼠分別給予 mTOR抑制劑 rapamycin和MAPK/ERK抑制劑 PD98059治療,檢測其對移植動脈新生內(nèi)膜形成的影響,以探討PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路在移植物動脈硬化中的作用。結(jié)果:慢病毒介導(dǎo) p53過表達有效誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡,凋亡血管平滑肌細胞釋放趨化因子SDF-1α,并誘導(dǎo)周圍血管平滑肌細胞表達 SDF-1α,引起 p53過表達血

5、管平滑肌細胞培養(yǎng)液中SDF-1α水平明顯升高。血管平滑肌細胞凋亡可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移和增殖,以 SDF-1α中和抗體可阻斷該作用。Western blot分析顯示血管平滑肌細胞凋亡活化骨髓間充質(zhì)干細胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路,且該作用是由 SDF-1α介導(dǎo)。用PI3K/Akt/mTOR抑制劑 Ly294002和rapamycin或 MAPK/ERK抑制劑 PD98059對骨髓間充質(zhì)干細胞進行預(yù)處理,

6、可有效阻斷血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖。與同系移植相比,異系移植動脈中膜平滑肌細胞大量凋亡,SDF-1α蛋白水平明顯升高,8周后異系移植動脈新生內(nèi)膜形成并伴有新生內(nèi)膜細胞 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路的活化。慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 BclxL基因,在 SM-22α啟動子調(diào)控下目的基因選擇性在移植動脈中膜平滑肌細胞高表達,使中膜平滑肌細胞凋亡明顯減少,移植動脈中膜 SDF-1α的表達下調(diào)及其在血清中的

7、含量下降;并且,伴隨早期移植動脈中膜平滑肌細胞凋亡抑制,8周后異系移植動脈新生內(nèi)膜中CD90和CD105雙陽性細胞的數(shù)量明顯減少,且血管新生內(nèi)膜面積和管腔狹窄程度均顯著減少。同樣,rapamycin和PD98059均能有效減少骨髓間充質(zhì)干細胞募集至新生內(nèi)膜以及移植動脈硬化。結(jié)論:移植動脈中膜平滑肌細胞凋亡通過產(chǎn)生SDF-1α募集骨髓間充質(zhì)干細胞,從而在移植物動脈硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信

8、號傳導(dǎo)通路活化是血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的分子機制。以血管平滑肌細胞凋亡為干預(yù)靶點將是防治移植物動脈硬化的一個有效策略。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分血管平滑肌細胞凋亡通過誘導(dǎo)產(chǎn)生 SDF-1α促進骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖
　　目的:移植物動脈硬化是以彌漫性內(nèi)膜增生為特征的慢性血管增殖性疾病。研究提示移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡可能通過募集骨髓間充質(zhì)干細胞參與移植物動脈硬

9、化。本研究擬探討血管平滑肌細胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細胞移植物動脈體外遷移和增殖的影響及其分子機制。方法:原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動子的野生型 p53基因慢病毒載體,采用DAPI細胞核染色和流式細胞術(shù)檢測過表達 p53對血管平滑肌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用,采用Western blot和ELISA分析檢測觀察血管平滑肌細胞凋亡對細胞因子 SDF-1α,TGF-β和PDGF-BB表達的影響。體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細

10、胞,制備 p53過表達血管平滑肌細胞條件培養(yǎng)液,采用Transwell細胞遷移分析和BrdU標(biāo)記法檢測血管平滑肌細胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的影響;并應(yīng)用選擇性細胞信號阻斷劑對骨髓間充質(zhì)干細胞進行預(yù)處理,以探討血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的分子機制。結(jié)果:慢病毒介導(dǎo) p53過表達有效誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡,凋亡血管平滑肌細胞釋放趨化因子 SDF-1α,并誘導(dǎo)周圍血管平滑肌細胞表達 SDF-1α,引起 p53過

11、表達血管平滑肌細胞培養(yǎng)液中SDF-1α水平明顯升高。血管平滑肌細胞凋亡可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移和增殖,以 SDF-1α中和抗體可阻斷該作用。Western blot分析顯示血管平滑肌細胞凋亡活化骨髓間充質(zhì)干細胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路,且該作用是由 SDF-1α介導(dǎo)。用PI3K/Akt/mTOR抑制劑 Ly294002和rapamycin或 MAPK/ERK抑制劑 PD98059對骨髓間充質(zhì)干細胞進行預(yù)

12、處理,可有效阻斷血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖。結(jié)論:血管平滑肌細胞凋亡通過產(chǎn)生 SDF-1α誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移和增殖,而PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路活化是血管平滑肌細胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的分子機制。
　　第二部分 移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡募集骨髓間充質(zhì)干細胞促進移植物動脈硬化
　　目的:移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡是器官移植后的早期事件,但在移植物

13、動脈硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制均不清楚。本研究擬探討移植物動脈中膜平滑肌細胞凋亡對移植物動脈硬化的促進作用及其分子機制。方法:建立大鼠主動脈移植模型,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動子的BclxL基因慢病毒載體,采用TUNEL分析檢測移植動脈中膜平滑肌細胞凋亡情況;采用免疫組化染色檢測移植動脈壁中SDF-1α的蛋白水平;采用HE和Masson染色進行組織病理學(xué)分析,探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對移植動脈新生內(nèi)膜形成的影響;并應(yīng)用免疫雙熒光

14、染色探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞參與內(nèi)膜增生的影響。同時,建立異系大鼠主動脈移植模型,對受體大鼠分別給予 mTOR抑制劑 rapamycin和MAPK/ERK抑制劑 PD98059治療,檢測其對移植動脈新生內(nèi)膜形成的影響,以探討 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路在移植物動脈硬化中的作用。結(jié)果:與同系移植相比,異系移植動脈中膜平滑肌細胞大量凋亡,SDF-1α蛋白水平明顯升高,8周后異系移植動脈新生內(nèi)膜形成

15、并伴有新生內(nèi)膜細胞 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路的活化。慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 BclxL基因,在 SM-22α啟動子調(diào)控下目的基因選擇性在移植動脈中膜平滑肌細胞高表達,使中膜平滑肌細胞凋亡明顯減少,移植動脈中膜 SDF-1α的表達下調(diào)及其在血清中的含量下降;并且,伴隨早期移植動脈中膜平滑肌細胞凋亡抑制,8周后異系移植動脈新生內(nèi)膜中CD90和CD105雙陽性細胞的數(shù)量明顯減少,且血管新生內(nèi)膜面積和管腔狹窄程度均顯著減少。