體內(nèi)灌注誘導骨髓基質干細胞構建組織工程骨的實驗研究.pdf

1、由創(chuàng)傷、感染、腫瘤、燒傷等引起的大塊骨缺損是臨床治療的棘手問題，采用傳統(tǒng)的自體骨或同種異體骨移植及生物材料填充，由于存在種種弊端，治療效果均不理想，嚴重限制了其臨床應用。組織工程技術的興起為解決這一難題帶來了希望，成為當前的研究熱點。然而，大塊組織工程骨血管化以及生長因子持續(xù)穩(wěn)定的釋放等關鍵性技術難題至今未找到理想的解決辦法。顯然，采用常規(guī)的思路對大塊骨缺損進行修復遇到了巨大的挑戰(zhàn)。為了找到一條可供臨床用來修復大塊骨缺損的組織工程之路，

2、本研究力圖探索出一條基于整體論和還原論相結合的骨組織工程研究的創(chuàng)新之路，并率先建立近同構模型——體內(nèi)灌注誘導成骨微環(huán)境系統(tǒng)?；谶@種認識，開展了以下一系列研究： 第1章山羊骨髓基質干細胞的體外培養(yǎng) 目的：將來源于山羊的骨髓基質干細胞(BMSC)，在特定的條件下定向誘導分化為成骨細胞，觀察其生物學特性，探討其作為骨組織工程種子細胞的可行性和應用價值。 方法：抽取健康山羊骨髓采用全骨髓法進行培養(yǎng)擴增，傳代后改用含地塞

3、米松(10-8mol/L)，β-甘油磷酸鈉(10mmol/L)和維生C(50mg/L)的條件培養(yǎng)基促使其向成骨細胞定向誘導分化。在相差顯微鏡、HE染色、光鏡下觀察細胞形態(tài)，并測定培養(yǎng)細胞的生長曲線(MTT法)，流式細胞術進行細胞表面特征鑒定，Gomori鈣鉆法進行ALP染色、Von Kossa法進行鈣結節(jié)染色，同時測定細胞內(nèi)ALP含量變化。 結果：原代和傳代培養(yǎng)的細胞具有活躍的增殖能力。誘導培養(yǎng)2-3周后，細胞生長良好，生化指標

4、穩(wěn)定，光鏡下表現(xiàn)出與典型的成骨細胞相似的形態(tài)特征。流式細胞術證明BMSC細胞膜抗原CD29，CD44，CD105表達陽性，而CD14，CD34和HLA-DR表達陰性，ALP及鈣結節(jié)染色等均為強陽性；ALP活性明顯增強。 結論：山羊BMSC取材安全方便，在特定條件誘導下，可定向誘導分化為具有典型形態(tài)學特點和功能的成骨細胞，山羊BMSC可作為理想的骨組織工程種子細胞來源。 第2章rhBMP-2及rhbFGF對山羊骨髓基質干細

5、胞增殖的效應 目的：檢測hBMP-2和hbFGF單獨及聯(lián)合作用對山羊骨髓基質干細胞(BMSC)增殖的效應。 方法：采用MTT法檢測單獨及聯(lián)合施加rhBMP-2和rhbFGF后，BMSC在第1，3，5，7及10天增殖的狀況，并進行統(tǒng)計學分析。 結果：rhBMP-2和hbFGF均能顯著地促進BMSC的增殖，并呈劑量依賴性。兩種生長因子聯(lián)合作用的效應高于單獨作用的效應。 結論：rhBMP-2和hbFGF具有協(xié)同

6、促進山羊BMSC增殖的效應。 第3章rhBMP-2及rhbFGF對山羊骨髓基質干細胞分化的效應 目的：檢測rhBMP-2和rhbFGF單獨及聯(lián)合作用對山羊BMSC的分化效應。 方法：采用堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒及考馬斯亮蘭測定法檢測單獨及聯(lián)合施加rhBMP-2和rhbFGF后，BMSC在第2，5，7及10天時的ALP活性及蛋白質含量水平以反映對細胞分化作用的影響，并進行統(tǒng)計學分析。 結果：rhBMP

7、-2能在較長時間內(nèi)明顯促進細胞ALP活性及蛋白質含量，而rhbFGF則起到抑制作用，且均呈劑量依賴性。rhBMP-2單獨作用與兩種生長因子聯(lián)合作用的效應相近，均高于hbFGF單獨作用的效應。 結論：rhBMP-2和hbFGF聯(lián)合應用與rhBMP-2單獨使用均能夠顯著地促進山羊BMSC的分化效應。 第4章增強型綠色熒光蛋白基因質粒轉染骨髓基質干細胞 目的：探討以脂質體介導法轉染的增強型綠色熒光蛋白質粒作為骨組織工程

8、種子細胞示蹤劑的可行性。 方法：選取12月齡中國青山羊2只作為BMSC供體。將已轉染pEGFP—N2的大腸桿菌109菌種，進行質粒提取并經(jīng)Ava Ⅱ酶切鑒定。脂質體(lipofectamine 2000)介導轉染羊BMSC細胞。分別于轉染24h、6月后計算熒光的轉染效率。以未標記的同期細胞作對照。 結果：質粒經(jīng)酶切后電泳，可見三條帶，分別為445bp，1938bp，2354bp，確定所提質粒為pEGFP—N2。轉染24h

9、后綠色熒光表達率35％；經(jīng)G418篩選，轉染6個月后綠色熒光表達率75％，同時對照組未觀察到綠色熒光。 結論：脂質體介導法轉染的。pEGFP—N2標記BMSC，是一種理想的標記方法。 第5章增強型綠色熒光蛋白基因質粒標記技術示蹤組織工程化骨形成 目的：探討以脂質體介導法轉染的增強型綠色熒光蛋白質粒作為骨組織工程種子細胞示蹤組織工程化骨形成的可行性。 方法：將標記與未標記細胞經(jīng)成骨誘導分化后，檢測堿性磷酸酶

10、(ALP)活性和四環(huán)素鈣結節(jié)染色，以未標記的同期細胞作對照。將標記細胞接種于珊瑚支架，形成BMSC-珊瑚復合物，分別于體外培養(yǎng)4d、7d、14d后進行電鏡掃描觀察。將體外培養(yǎng)7d的BMSC-珊瑚復合物移植于裸鼠皮下，8周后取出，熒光顯微鏡下進行示蹤觀察，HE染色觀察組織結構。以未標記的BMSC-珊瑚復合物、單純珊瑚作對照。 結果：與對照組相比，標記細胞堿性磷酸酶活性差異無統(tǒng)計學意義，均具有鈣結節(jié)形成能力。標記細胞與珊瑚材料貼附生

11、長良好，并分泌膠原纖維及鈣鹽結晶樣基質。組織學示新生骨樣組織圍繞材料孔隙生成；新生組織細胞內(nèi)有綠色熒光清晰表達，同時對照組未觀察到綠色熒光。 結論：脂質體介導法轉染的pEGFP-N2標記BMSC，可用于裸鼠體內(nèi)示蹤，是一種理想的組織工程化骨組織的示蹤方法。 第6章山羊脛骨大節(jié)段骨缺損模型的制備 目的：為骨組織工程的研究提供理想的動物模型。 方法：取9只青山羊隨機分3組，制備單側脛骨25mm的骨膜與骨缺損，

12、重建鋼板內(nèi)固定，術后放射學檢查、組織學方法評價骨缺損自行修復情況。 結果：術后所有動物骨缺損處x線片Lane評分均為0分，組織學顯示無骨組織長人。 結論：山羊脛骨適于制備骨缺損和重建鋼板內(nèi)固定模型，其25mm大段骨缺損模型是研究組織工程骨較為理想的動物模型。 第7章近同構模型修復山羊脛骨大段骨缺損的初步研究 目的：探索骨組織工程近同構模型修復羊脛骨干骨缺損的可行性。 方法：體外擴增自體骨髓基質干細

13、胞，與珊瑚支架材料復合，植入山羊脛骨缺損處，同時通過便攜式微量泵聯(lián)合皮下植入式給藥裝置，建立近同構模型-可調(diào)控的體內(nèi)灌注誘導成骨微環(huán)境系統(tǒng)，定時注入DMEM培養(yǎng)液、細胞因子rhbFGF和rhBMP-2。 結果：術后8W觀察結果：術后8W組織切片HE染色觀察到近同構模型組骨組織形成；對照組僅見纖維組織長入。x線觀察，術后8W近同構模型組織工程骨周圍形成骨痂，并與脛骨缺損端融合；對照組術后8W時支架材料部分降解、吸收。 結論