犬臍血MSC異體移植和對心肌梗死作用的研究.pdf

1、目的：研究犬臍血間質干細胞同種異體移植免疫耐受的可能性和相關的免疫學特征以及對心梗后心臟功能的影響. 方法：選取孕齡50天左右的妊娠犬,取臍帶血,密度梯度離心法分離單個核細胞,應用IMDM液培養(yǎng)擴增干細胞,免疫組化法檢測細胞表面抗原CD34、CDI 1a、CD11b、CD29、CD71的表達,確認間質干細胞.選取第四代的間質干細胞,免疫組化染色檢測其MHC-I和MHC-II的表達,觀察5-aza誘導分化、IL-1β、INF-γ和

2、INF-α對其MHC-II表達有何影響.rAAV1/2-LacZ轉染間質干細胞,采用X-gal化學染色法檢測標記基因產物β-gal.成年犬36條,隨機分為實驗組與對照組.應用結扎冠狀動脈左前降支法建立急性心肌梗死動物模型.實驗組將異體的間質干細胞經冠狀動脈注入梗塞區(qū)域,對照組僅注射等量IMDM培養(yǎng)液.分別于術后2、4、8周在DSA下行左心室造影測定心功能,然后處死動物,取心肌組織免疫組化染色法檢測表達β-gal的細胞,以確定移植問質干細

3、胞的存活和心肌再生.TUNEL法檢測梗塞區(qū)域心肌細胞的凋亡,免疫組化染色法測定梗塞區(qū)域心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達,探討干細胞移植對心肌細胞凋亡的影響.免疫組化法測定梗塞區(qū)域浸潤的CD4+T、CD8+T,觀察間質干細胞移植對T淋巴細胞分布的影響.應用Image-Pro Plus 5.1.0.20軟件進行圖像分析,計算光密度(density)值和累積光密度(IOD)值.數據用均數±標準差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(

4、ANOVA)和t檢驗,P<0.05認為有統(tǒng)計學顯著性差異.SPSS11.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理. 結果：培養(yǎng)的細胞呈現長梭形,表面抗原表達為:CDIla(-)、CDllb(-)、CD34(-)、CD29(+)、CD71(+),提示為間質干細胞.rAAV1/2-LacZ可高效轉染臍血間質干細胞,并能長期表達標記基因LacZ的產物β-gal.檢測表明,臍血間質干細胞為MHC-I(+)、MHC-II(-),培養(yǎng)液中加入炎癥因子IL-

5、1β、INFγY、以及INF-α培養(yǎng)72h后,臍血間質干細胞仍為MHC-II(-).5-aza.誘導后并經LacZ報告基因標記的間質干細胞經冠狀動脈移植入急性心梗心臟的梗塞區(qū)域,移植的細胞在梗塞周邊區(qū)存活并與殘存心肌形成緊密連接.術后2、4、8周左心室造影測定心功能顯示,實驗組的EF值明顯高于對照組,而LVEDVI明顯低于對照組.實驗組的心肌細胞凋亡的IOD值低于對照組,Bcl-2蛋白表達量明顯高于對照組,而Bax蛋白表達量低于對照組.

6、實驗組CD4+的IOD值以及CD4+/CD8+的IOD比值明顯低于對照組,而CD8+T的IOD值顯著高于對照組. 結論：臍血間質干細胞為MHC-Ⅱ(-)細胞,炎癥因子IL-1β、INF-α以及INF-γ不能誘導其表達MHC-Ⅱ分子,因而具有極低的免疫原性:同種異體的臍血間質干細胞梗塞心肌移植后能長時間存活,其免疫抑制作用減少了局部CD4+T細胞的浸潤,維持CD4+/CD8+T在較低水平,表明宿主在一定程度上對移植的異體間質干細胞