

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、腦缺氧導致嚴重的細胞變性,因而腦功能喪失。當前普遍認為,缺氧損傷中谷氨酸大量釋放,導致細胞內過量的Ca<'2+>蓄積,從而引起神經元死亡。 鈉泵又稱Na<'+>,K<'+>-ATP酶,是一種膜結合蛋白,可通過水解一分子ATP將三個Na<'+>轉運到細胞外同時攝取兩個K<'+>進入細胞,產生電化學梯度,維持細胞滲透壓平衡和靜息電位,因此鈉泵是維持Na<'+>動態(tài)平衡、體液和電解質穩(wěn)態(tài)的關鍵。 當哺乳動物腦組織的氧或血流供應
2、低于臨界值時就會出現能量障礙,僅僅缺氧5 min ATP下降90%,而丟失50~60%的ATP時鈉泵活性下降,細胞膜去極化進而鈉和水進入細胞內。去極化使電壓門控性鈣通道開放Ca<'2+>內流,同時崩塌的Na<'+>梯度引起Na<'+>依賴性谷氨酸轉運體排除谷氨酸到細胞間隙,激活谷氨酸受體導致大量Ca<'2+>內流,繼而出現Ca<'2+>依賴性細胞損傷。 由此可見,鈉泵在腦缺血的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。但目前對其研究大多數
3、集中在心肌細胞、腎臟、骨骼肌、血管平滑肌,而對腦組織鈉泵的分布及功能特性研究較少,特別是其在腦缺血、缺氧狀態(tài)下,功能和特性的改變及其可能機制的研究甚少,本研究旨在選取對缺血較敏感的皮層神經元(Ⅴ和Ⅵ層錐體細胞),研究鈉泵電生理特性及其在缺氧中的改變,并探討其可能機制。 一、腦片皮層神經元鈉泵的電生理特性 目的:應用腦片皮層神經元研究鈉泵電流的特性。 方法:選取出生11~14天SD大鼠,深度麻醉后斷頭,快速取出腦組
4、織放入冰冷的人工腦脊液(ACSF)中,取前腦切成300 μm的溥片,儲存在95%O<,2>+5%CO<,2>飽和的ACSF中。然后將制備好的皮層腦片放置于灌流槽中,持續(xù)灌流95%O<,2>和5%CO<,2>飽和的ASCF,流速為1~2ml/min,使腦片浸沒于液面下。在紅外微分干涉相差顯微鏡下,移動電極至細胞上方負壓吸引形成封接,再以負壓吸破細胞膜,使電極內液與細胞內液相通,并將細胞鉗制在-60mV,當膜電流穩(wěn)定時,先通過膜去極化程序(
5、-60mV-0mV--60mV)激活Na<'+>電流來鑒別正在記錄的細胞是神經元,然后換為含不同濃度哇巴因(Oua,10<'-12>~10<'-3>mol/L)的ACSF,以全細胞膜片鉗方式記錄皮層神經元鈉泵電流,并以10<'-3>mol/L Oua產生的泵電流幅度為100%,計算各濃度Oua產生的泵電流(Ip)的變化率(△Ip),并以此為縱坐標,以Oua濃度([Oua])為橫坐標,繪制△Ip-[Oua]關系曲線。整個實驗在室溫(23±
6、2℃)下進行結果:實驗結果表明,當膜電壓鉗制在-60mV時,低濃度Oua灌流可引起膜電流的外向移動,但較高濃度的Oua灌流,則可劑量依賴性引起膜電流的內向移動,其中1 mmol/L Oua引起的膜電流內向移動幅度與切換無K細胞外液所致的膜電流內向移動幅度相同,證明該Oua敏感性電流為鈉泵電流。 本研究采用10<'-12>~10<'-3>mol/L的Oua分別在96個神經元測定了泵電流,根據神經元鈉泵對10<,-8>mol/L O
7、ua的反應,可將鈉泵電流對Oua(10<'-12>~10<'-3>mol/L)的△Ip-[Oua]關系曲線分為興奮、抑制和無作用三種模式。 結論:皮層的錐體神經元表達兩種功能不同的鈉泵,即高親和力鈉泵和低親和力鈉泵。鈉泵電流不僅具有Oua敏感性還具有電壓依賴性。 二、缺氧對皮層神經元鈉泵的影響 目的:研究缺氧對皮層神經元鈉泵活性和α亞基表達的影響。 方法:通過缺氧培養(yǎng)皮層神經元以及用N<,2>飽和的無糖A
8、CSF灌流皮層腦片,建立皮層神經元的氧糖分離缺氧模型。通過檢測缺氧0、2、4、8和12小時后培養(yǎng)皮層神經元培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量,評價缺氧對培養(yǎng)皮層神經元的損傷程度;應用激光共聚焦顯微鏡檢測缺氧0、0.5、1、2、4和8小時后培養(yǎng)皮層神經元內Ca<'2+>濃度([Ca<'2+>]<,i>)(fluo-3的熒光強度)的變化;采用TTC染色評價缺氧0、5、10、15、30、45和60rnin對皮層腦片神經元活性的影響。 通
9、過無機磷分光光度計法,檢測缺氧培養(yǎng)皮層神經元在缺氧0、2、4和8小時鈉泵活性的改變;通過雙酶法,檢測皮層腦片缺氧0、15、30和60min時鈉泵活性的改變。采用腦片膜片鉗裝置觀察缺氧0、2、4、6、8、10、15和20min對腦片皮層神經元鈉泵電流的改變。 采用RT-PCR和Westerrlblot方法,觀察缺氧0、4、8和12小時對培養(yǎng)皮層神經元α 1和α 3亞基mRNA和蛋白表達的影響,以及缺氧0、5、10、1 5、30和6
10、0min對皮層腦片α 1和α3亞基mRNA和蛋白表達的影響。 結論:采用缺氧孵育腦片和缺氧培養(yǎng)神經元模型可成功模擬兩種不同的缺氧性腦損傷。在缺氧早期階段皮層神經元鈉泵活性代償性升高,但隨缺氧時間的逐漸延長活性降低。缺氧培養(yǎng)調節(jié)皮層神經元mRNA和蛋白水平的表達,α 1亞基表達升高,α3亞基表達降低 三、低親和力鈉泵參與了皮層神經元缺氧損傷 目的:比較皮層神經元高親和力鈉泵和低親和力鈉泵在缺氧損傷中的作用。
11、 方法:通過灌流不同時間無糖低氧ACSF,制備培養(yǎng)的皮層神經元和皮層腦片的氧糖分離模型。缺氧0、2、4、6、8或10min觀察皮層腦片神經元膜電流的改變(△I/Cm),或者給予TTX(1 μmol/L)后同時缺氧,或者缺氧6min時給予TTX繼續(xù)缺氧觀測膜電流的改變。 鈉泵對缺氧所致皮層腦片神經元膜電流變化的影響:采用Oua 10nmol/L興奮高親和力鈉泵、Oua 100 nmol/L抑制高親和力鈉泵或者Oua10μmol/L
12、部分抑制低親和力鈉泵后,檢測缺氧0、2、4、6、8和10min 時△I/Cm。## 鈉泵對缺氧所致皮層腦片神經元[Ca<'2+>]<,i>和[Na<'+>]<,i>變化的影響:采用可視化動緣探測系統(tǒng)檢測培養(yǎng)的皮層神經元[Ca<'2+>]<,i>和[Na<'+>]<,i>熒光信號(Fura-2 10 μmol/L和SBFI 10 μmol/L),①無氧無糖的HBS灌流培養(yǎng)的皮層神經元10 min,分別于缺氧0、2、4、6、8和1 0 mi
13、n時測定神經元[Ca<'2+>]<,i>熒光比值(ARatio),比較不同時間點△Ratio。②連續(xù)灌流含Oua(10<'-9>~10<'-3> mol/L)的正常HBS 2 min,測定[Na<'+>]<,i> △Ratio。③以Oua 100nmol/L、10 μmol/L或1 mmol/L的正常HBS預先處理皮層神經元,然后換為含有同樣濃度Oua的無氧無糖HBS,連續(xù)記錄10 min,測量0、2、4、6、8和10 min時神經元[
14、Ca<'2+>]<,i> ARatio。 結果:缺氧增大神經元膜電流:無糖低氧ACSF灌流10 min,神經元膜電流則逐漸增大(P<0.0 1),在缺氧0、2、4、6、8和10 min時,其增加的膜電流密度分別為0、-0.014±0.006、-0.028±0.013、-0.035±0.016、-0.044±0.022、-0.058±0.026和-0.074±0.025 pA/pF,呈時間依賴性升高(r=0.98028,P<0.0
15、1),說明缺氧可引起皮層神經元膜上離子通道的異常開放。 缺氧增大的膜電流為TTX敏感性Na通道電流:在阻斷K<'+>和Ca<'2+>通道的液體環(huán)境中,所記錄到的膜電流主要為鈉電流,缺氧引起的腦片皮層神經元膜電流增加可以被TTX(1μmol/L)阻斷。若先使神經元急性缺氧6 min后再給予TTX,則TTX可抑制缺氧增加的膜電流繼續(xù)增大,僅使其維持在缺氧6 min時的電流水平而不能恢復至正常,在10 min時,膜電流的改變值為-0.
16、033±0.013 pA/pF,與缺氧10 min時-0.058±0.028 pA/pF相比較有顯著差異(P<0.01)。提示缺氧引起的膜電流增加可能與去極化所致的鈉通道開放有關。 結論:缺氧使Na+進入皮層神經元以及[Ca<'2+>]<,i>升高,同時阻斷鈉泵功能可通過升高皮層神經元[Na<'+>]<,i>水平影響[Ca<'2+>]<,i>,以及完全抑制鈉泵功能,可在4 min以內阻斷缺氧介導的皮層神經元[Ca<'2+>]<,
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- Humanin保護培養(yǎng)皮層神經元缺氧性損傷作用的觀察.pdf
- 光柵刺激下大鼠初級視覺皮層神經元間動態(tài)相關性研究.pdf
- 中樞神經元缺氧誘導因子1表達及其與神經元缺氧損傷關系的研究.pdf
- 鈉泵參與大鼠皮層大錐體細胞的缺氧性損傷.pdf
- 大鼠皮層神經元缺血再灌注損傷相關保護機制的研究.pdf
- 脊髓損傷大鼠觸液神經元與內源性神經干細胞相關性研究.pdf
- Humanin保護缺氧誘導神經元損傷的機制研究.pdf
- 小細胞肺癌與抗神經元抗體的相關性研究.pdf
- Homer1a在NMDA神經元損傷中的作用及其與nNOS相關性研究.pdf
- 機械性鼠腦皮層下橫切后皮層神經元凋亡
- 新生大鼠皮層神經干細胞定向分化為神經元過程中溶酶體與微管蛋白的相關性研究.pdf
- 色素上皮源性因子對海馬神經元和皮層神經元生長的影響.pdf
- 氯化鑭導致原代大鼠皮層神經元損傷作用的研究.pdf
- SIV感染恒河猴大腦額葉皮質menin表達上升與神經元損傷的相關性.pdf
- 斜視性弱視視皮層神經元時空特性的改變及其相關機制研究.pdf
- 大鼠皮層神經元內質網應激相關凋亡的實驗研究.pdf
- 西洋參皂苷對缺氧性大腦皮層神經元壞死及凋亡的影響.pdf
- 骨髓源性神經元樣細胞與皮質神經元間功能突觸的建立.pdf
- 19719.整合發(fā)放神經元發(fā)放率與輸入相關性研究
- 白藜蘆醇對神經元缺氧缺血損傷保護機制的研究.pdf
評論
0/150
提交評論