多效生長因子Pleiotrophin對Schlafen2基因表達的影響及其調控機制的研究.pdf

1、目的：在多效生長因子(Pleiotrophin，Ptn)基因穩(wěn)定沉默的小鼠胚胎成纖維細胞Ptn-siRNA B/MEF241中，研究Pleiotrophin對Schlafen2(Slfn2)基因表達的影響，以及在此調控過程中可能涉及的細胞因子；探討Ptn沉默誘導Slfn2基因表達可能涉及的信號通路。 方法：前期研究發(fā)現(xiàn)，多效生長因子(Pleiotrophin，Ptn)基因穩(wěn)定沉默的小鼠胚胎成纖維細胞Ptn-siRNA B/MEF

2、241中Schlafen2(Slfn2)基因高表達。在本實驗中，(1)為了驗證Ptn是否可能通過調控某種分泌型因子來抑制Slfn2表達，用Ptn穩(wěn)定沉默細胞的培養(yǎng)液培養(yǎng)對照NC細胞，通過Northern雜交法檢測培養(yǎng)不同時間后NC細胞中Slfn2表達水平變化，同時應用RT-PCR檢測Ptn沉默細胞內IL-1a和IL-1f6表達水平，以及外源性PTN因子(終濃度50ng/μl)對Ptn沉默細胞內IL-1表達水平的影響；分別使用重組人白細胞

3、介素-1受體拮抗劑(rhlL-1ra)和IL-1a中和抗體阻斷IL-1的作用通路，檢測Ptn穩(wěn)定沉默細胞中Slfn2基因表達變化。 (2)為了探討Ptn沉默誘導Slfn2基因表達可能涉及的信號通路，應用Western印跡檢測Ptn沉默細胞及NC細胞JNK磷酸化基礎水平，以及外源性PTN因子(終濃度50 ng/μl)對Ptn沉默細胞JNK磷酸化水平的影響；用SP600125和SB203580特異性阻斷JNK和p38通路，Northern印

4、跡分析Ptn沉默細胞Slfn2基因轉錄水平的變化。(3)為了進一步驗驗證Ptn沉默細胞內表達上調的IL-1是否也對JNK通路具有調控作用，分別使用重組人白細胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)和IL-1a中和抗體阻斷IL-1的作用通路，應用Western印跡檢測Ptn穩(wěn)定沉默細胞中JNK磷酸化水平的變化。 結果：(1)Ptn沉默細胞中Slfn2表達顯著上調，Ptn沉默細胞培養(yǎng)液可以誘導對照細胞Slfn2表達；Ptn沉默后細胞

5、內IL-1a和IL-1f6表達顯著上調，外源性PTN能抑制沉默細胞中IL-1a和IL-1f6的表達； IL-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)和IL-1a中和抗體可抑制Ptn沉默細胞中Slfn2表達。 (2)Ptn沉默誘導細胞內磷酸化JNK蛋白高表達，此誘導效應可被外源性PTN抑制；阻斷JNK通路呈時間依賴性抑制Ptn沉默細胞中Slfn2基因表達；阻斷p38通路對Ptn沉默細胞中Slfn2表達水平沒有明顯影響。 (3)IL-1受體拮抗劑(