重組慢病毒介導PPM1B基因轉染延緩大鼠失神經骨骼肌萎縮的基礎研究.pdf

1、肌萎縮是公認的世界疑難病癥，以失神經肌萎縮為例，其一旦發(fā)生則呈進行性不可逆發(fā)展，目前尚無有效措施及藥物可完全阻斷這一病程，給患者及其家庭帶來了沉重的精神和經濟負擔。因此，探討失神經肌萎縮發(fā)病的分子機制及尋找新的治療方法顯得尤為重要和迫切。迄今的研究已經明確，失神經骨骼肌的萎縮是由分子信號通路掌控，IKKβ/NF-κB通路在其中占有重要的作用。磷酸化的IKKβ去磷酸化與否可能對失神經骨骼肌的發(fā)生發(fā)展有重要意義。依賴鎂/錳離子的蛋白磷酸酶1

2、B(PPM1B)可以使磷酸化的IKKβ的絲氨酸177和絲氨酸181位點發(fā)生去磷酸化，同時減弱IKKβ的活性。過表達PPM1B甚至可以終止由TNF-α誘導的IKKβ/NF-κB通路的活性。基因治療為失神經骨骼肌萎縮的防治開辟了更廣闊的前景，已有學者發(fā)現應用神經營養(yǎng)因子、轉化生長因子等基因轉染和轉基因小鼠的方法對延緩肌萎縮有較好的效果。受此啟發(fā)，本課題嘗試采用基因轉染技術來促進PPM1B基因過表達，使失神經肌萎縮的重要通路在上游及時得到控制

3、，借此來抑制IKKβ/NF-κB通路的活性，探討其延緩骨骼肌萎縮的療效，為進一步研究失神經骨骼肌萎縮的分子機制及針對該因子的藥物和基因干預提供實驗依據。
　　 第一部分:
　　 PPM1B和P-IKKβ在失神經肌萎縮中的達變化及意義
　　 目的:探討失神經骨骼肌萎縮過程中依賴鎂/錳離子的蛋白磷酸酶1B(PPM1B)和磷酸化的抑制核轉錄因子κB激酶β(P-IKKβ)的表達變化及意義。方法:30只SD大鼠建立右下肢腓

4、腸肌失神經支配模型，采用實時定量PCR和Westemblot，分別檢測失神經支配第2、7、14和28天的腓腸肌中PPM1BmRNA和蛋白的表達變化以及P-IKKβ，IKKβ蛋白的表達變化，并分析PPM1B，P-IKKβ與肌萎縮程度（肌肉濕重維持率）的相關性。結果:1、實時定量PCR分析結果顯示PPM1BmRNA的表達在失神經支配后第2天已開始下降，迅速降為對照組的0.41倍，此后表達水平持續(xù)下降，到第28天時降為對照組的0.07倍，各組

5、與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。2、Westernblot灰度分析結果顯示PPM1B蛋白水平的變化與mRNA水平有著相同的趨勢，但是變化幅度較轉錄水平為低；失神經2天表達水平持續(xù)下降，第7天降為對照組的0.56倍，到第28天時降為對照組的0.24倍。失神經術后第2天與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第7，14，28天與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。P-IKKβ蛋白的表達水平從早期即開始增高，失

6、神經第2天為對照組的1.37倍，并隨著失神經時間的推移而呈持續(xù)增加趨勢，到第28天為對照組的1.74倍。各組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。IKKβ蛋白的表達呈持續(xù)下降的趨勢，下降幅度較小。各組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3、關聯(lián)性分析顯示PPM1B與P-IKKβ表達呈現負相關性(P＜0.01);PPM1B表達降低與肌濕重比成線性正相關關系(P＜0.01)。結論:在SD大鼠失神經骨骼肌萎縮早期，P

7、PM1B的表達為下調，P-IKKβ的表達為上調；PPM1B和P-IKKβ在失神經骨骼肌的表達強度與肌萎縮密切相關，二者共同作用參與失神經骨骼肌的發(fā)生發(fā)展。采用基因治療促進PPM1B基因表達使其上調，來延緩失神經骨骼肌萎縮，應在失神經后越早越好。
　　 第二部分:
　　 PPMIB基因慢病毒載體的構建與鑒定
　　 目的:構建PPMIB基因重組慢病毒載體，為其體外實驗奠定基礎。方法:根據PPM1B基因的CDS序列，對

8、大鼠PPM1B基因進行ORF克隆，陽性克隆經菌落PCR驗證及測序驗證后，將測序正確的T-PPM1B進行雙酶切，與雙酶切后的pLenti6.3/V5DEST(MCS)-IRES-EGFP相連接，菌落PCR及酶切鑒定篩選出陽性克隆，測序。保留正確的pLenti-EGFP-PPM1B，提純后與包裝質粒共轉染293T細胞，獲得病毒原液，經純化和濃縮后，進行測序分析鑒定。結果:1、構建的慢病毒表達載體pLenti-EGFP-PPM1B經過測序驗證

9、與GenBank中PPM1B的CDS序列完全一致。2、慢病毒表達載體轉染到293T細胞，熒光顯微鏡下可見細胞中有大量明亮的綠色熒光表達，病毒液的滴度值為1.15×107ifu/ml，實時定量PCR檢測病毒液中PPM1B基因表達量是陰性對照液中的297.48倍。結論:成功構建了PM1B基因慢病毒載體，為下一步體外實驗奠定了基礎。
　　 第三部分:
　　 重組慢病毒體外促進PPMIB的表達
　　 目的:探討重組慢病毒

10、體外促進PPM1B基因表達的效果，為重組慢病毒介導的失神經骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎。方法:6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)大鼠成肌細胞系L6,感染L6細胞，摸索最佳MOI值。將培養(yǎng)好的L6細胞分為三組，分別為無干預因素的未感染組，感染Lenti-EGFP空載體病毒的對照組，感染Lenti-IRES2-EGFP-PPM1B的病毒組，進行相應的感染后72h，取各組細胞于共聚焦熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達、以發(fā)綠色熒光細胞的平均

11、數與總細胞平均數的比值來估計感染的效率、Westernblot檢測PPM1B蛋白的表達。結果:1、慢病毒感染L6大鼠成肌細胞的MOI值選取MOI=20為最佳。2、病毒組感染后72h，熒光顯微鏡下可見細胞中有大量明亮的綠色熒光表達，顯示了系統(tǒng)有著較高的感染效率。3、Westernblot灰度分析，感染后72h，病毒組PPM1B基因的蛋白表達較對照組和未感染組明顯升高，分別是它們的15.3倍和14.9倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

12、對照組與未感染組相比，PPM1B蛋白表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。結論:成功驗證了重組慢病毒可以促進細胞中PPM1B的蛋白表達，為下一步在活體內研究其功能以及基因靶向治療奠定了基礎。
　　 第四部分:重組慢病毒介導PPMIB基因轉染
　　 延緩大鼠失神經骨骼肌萎縮
　　 目的:探討重組慢病毒介導的PPM1B基因轉染延緩大鼠失神經骨骼肌萎縮的療效。方法:將30只SD大鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組15只。

13、切斷坐骨神經，建立右下肢失神經支配萎縮模型。于實驗組和對照組失神經趾長伸肌分別感染重組慢病毒載體Lenti-EGFP-PPM1B和Lenti-EGFP溶液50μl(107IU/ml)，轉染2、4周，每個時間點分別取3只大鼠，于共聚焦熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達，取6只大鼠，Westernblot檢測PPM1B、P-IKKβ和IKKβ的表達；取6只大鼠測定肌濕重、肌細胞直徑、肌細胞橫截面積，并觀察肌纖維超微結構的變

14、化。結果:慢病毒轉染2、4周，兩組趾長伸肌均可見大量EGFP表達。Westernblot檢測顯示實驗組失神經趾長伸肌中均有大量的PPM1B表達，分別為對照組的6.8倍與4.9倍（P均＜0.01）。實驗組中P-IKKβ蛋白較對照組減少，分別為對照組的45％與62％；實驗組中IKKβ蛋白較對照組增多，分別為對照組的4.2倍與2.8倍（P均＜0.05）。轉染2周，實驗組肌濕重維持率、肌細胞直徑和肌細胞橫截面積分別為(63.28±4.17)％，

15、(30.86±4.24)μm和(880.72±70.54)μm2，均明顯高于對照組(52.43±3.92)％，(21.39±3.87)μm和(705.27±53.19)μm2;4周時，實驗組上述各項指標為(45.13±4.95)％，(23.64±3.06)μm和(720.15±38.46)μm2，仍明顯高于對照組(35.31±4.72)％，(18.66±3.23)μm和(543.67±42.65)μm2（P均＜0.01）。此外，實驗組與