分娩性臂叢麻痹失神經肌肉萎縮基因調控特征的基礎研究.pdf

1、第一部分手內肌萎縮速度快于上肢大肌肉的大鼠模型建立
　　目的：在分娩性臂叢麻痹的臨床病例中，神經修復手術對于手內肌的效果遠不及上臂大肌肉。失神經肌肉發(fā)生不可逆萎縮后，即使神經再生非常成功，也難以恢復形態(tài)和收縮功能。在分娩性臂叢麻痹臨床診治的證據表明，手內肌進入的不可逆萎縮速度要遠大于上肢大肌肉，這提示手內肌失神經肌萎縮過程中的自我調節(jié)機制可能不同于肱二頭肌。本部分實驗的目的是建立臨床上失神經后手內肌萎縮速度快于上肢大肌肉的大鼠模型

2、，以闡明兩種肌肉對手術時機敏感性不同的形態(tài)學基礎，為進一步基因研究提供理想的動物模型。
　　方法：將64只新生大鼠模擬臨床上分娩性臂叢麻痹的常見類型建立模型——C5C6斷裂和C7C8T1撕脫，并將其平均分為重建組和對照組。對于重建組，在神經損傷術后1、5、10、15周后分別取8只大鼠行尺神經和肌皮神經的修復手術，依次分為R1、R5、R10、R15亞組，對大鼠行神經移植修復術:C6→尺神經，C5→肌皮神經方式修復神經，并且使用2股腓

3、腸神經移植，于術后12周取材分析。而在對照組，則在神經損傷術后1、5、10、15周后分別取8只大鼠直接取材分析，依次分為C1、C5、C10、C15亞組。之后對大鼠進行1）神經傳導研究:對重建組大鼠，分別暴露兩側肌皮神經和尺神經以及前肢相應的待檢肱二頭肌和爪內肌，記錄兩側潛伏期及誘發(fā)肌電位的波幅。2）有髓神經纖維計數:將飼養(yǎng)12周后的32只實驗組大鼠進行有髓神經纖維計數分析:取雙側腕部為尺神經取材點，肱二頭肌入肌點處為肌皮神經取材點，通過

4、圖像分析軟件計算有髓神經軸突的數量。3）肌肉組織形態(tài)學分析:每只大鼠的雙側肱二頭肌和爪內肌均在手術操作顯微鏡下取出，均行HE染色，Masson三色染色和TUNEL染色，分別用以觀察肌肉萎縮，纖維增生和凋亡的情況。利用圖像分析軟件，測量肌纖維的平均截面積，并與左側肌肉的該數值進行比較并計算肌細胞截面積恢復率。每張Masson染色切片統計膠原纖維截面積比。凋亡指數是予以分析樣本中凋亡的肌細胞核占所有細胞核數量的比例，利用TUNEL細胞凋亡原

5、位檢測法標記切片中的凋亡肌細胞核，每張切片在20倍物鏡下連續(xù)觀察3-5個視野，數至1000個細胞核中凋亡細胞核所占的比例即為凋亡指數(AI，％)。每組數據根據分布以中位數（四分位區(qū)間）或均值士標準差的形式表示。采用Mann-Whitney U test來分析組間差異，所有值的概率都為雙尾，統計學差異設定為0.05。
　　結果 ：R1、R5亞組中，尺神經和肌皮神經的復合肌肉動作電位均能測出。R10亞組中，肌皮神經仍可測出復合肌肉動作

6、電位，而尺神經已無法測出。尺神經和肌皮神經在R15亞組內均無法測出復合動作電位。在重建組中，大鼠右側上肢尺神經有髓神經纖維數與上左側正常尺神經纖維數的比值的最小值在R1亞組內為85％，R5為70％，R10為73％，R15為53％;對于肌皮神經，最小比值在R1亞組內為79％，R5為66％，R10為62％，R15為67％。
　　R1亞組前肢爪內肌的肌纖維截面積恢復率明顯優(yōu)于C1亞組，但R5、R10、R15亞組的恢復率與各自的對照組C5

7、、C10、C15亞組之間的差異無統計學意義。對于肱二頭肌，R1、R5、R10亞組的肌纖維截面積恢復率明顯優(yōu)子C1、C5、C10亞組，R15和C15的恢復率差異無統計學意義。前肢爪內肌的截面積膠原比在R1亞組小于C1亞組，R5、R10、R15各亞組卻與各自的對照組間的差異無統計學意義。R1，R5亞組的肱二頭肌截面積膠原比與C1、C5亞組的差異有顯著統計學意義，而R10、R15和C10、C15的恢復率的差異卻無統計學意義。R1和R5亞組的前

8、肢爪內肌凋亡指數分別低于C1和C5亞組，但R10、R15卻與各自對照組C10、C15亞組的差異無統計學意義。對于肱二頭肌，凋亡指數在R1、R5、R10亞組分別低于C1、C5、C10亞組，但R15和C15之間無明顯差異。凋亡指數呈在早期上升而到后期又下降的一種變化趨勢。
　　結論：本實驗證實了大鼠的產癱模型適用于研究臨床上手內肌進入不可逆萎縮速度大于上肢大肌肉這一現象。
　　第二部分應用基因芯片技術篩選大鼠前肢爪內肌和肱二頭肌

9、在失神經肌萎縮過程中的差異表達基因
　　目的：盡管目前臨床周圍神經損傷后的形態(tài)修復已經幾乎達到完美程度，但是神經功能修復的療效仍然不理想:公認恢復不佳的主要原因之一，是失神經肌肉在再生神經到達之前，已經發(fā)生不可逆萎縮。但臨床上手內肌和上臂大肌肉失神經后存在的兩種截然不同的萎縮進程卻提示，肌肉中也可能存在影響萎縮速度的因素。
　　骨骼肌肉萎縮的過程中無論是從時間還是空間上，都存在炎癥、凋亡和重建、再生的反復交替的過程，而且都是

10、一個或多個基因群協同作用的結果?；虮磉_譜芯片可以大規(guī)模檢測生理和各種病理條件下各基因的表達水平和變化情況，更能從全局的角度了解基因的表達情況和變化規(guī)律，為全面認識基因的功能和基因間的相互關系提供線索。本次研究的目的是利用基因芯片技術篩選大鼠前肢爪內肌和肱二頭肌在失神經肌萎縮過程中的差異表達基因及相關的網絡調控模式，為找到影響肌萎進程中的關鍵基因和通路奠定基礎，從而為臨床確立失神經肌萎縮進入不可逆萎縮狀態(tài)的分子指標提供理論基礎。

11、　　方法：選取64只新生7天大鼠行C5—T1全臂叢撕脫，并根據術后1、5、10、15周的時間分為4組，每組16只。在大鼠行肌肉取材前，先進行有髓神經纖維染色觀察:取腕部為尺神經取材點，肱二頭肌入肌點處為肌皮神經取材點，盡量選取靠近遠端的完整神經組織，排除神經交叉在支配的可能。將每只大鼠雙側的前肢爪內肌和肱二頭肌都取材備用。每個樣本的總RNA使用NanoDrop ND-1000進行定性和定量檢測，瓊脂凝膠電泳檢測其是否符合標準。使用Agi

12、lent微陣列芯片進行基因表達分析，按照標準方法進行的樣品制備和芯片雜交。AgilentFeature Extraction software(version10.7.3.1)進行陣列圖像分析。數據處理使用的GeneSpring GX v11.5.1軟件(Agilent Technologies)。通過散點圖、火山圖篩選具有統計意義的差異表達基因。聚類分析用以分析各樣本間的區(qū)別基因表達譜。應用Pathway和GO分析，以確定這些基因在整

13、個生物過程中發(fā)揮的功能。最后，篩選出與失神經肌萎縮相關的重點通路和基因。
　　結果：我們利用基因芯片，對16組32個樣本進行表達譜分析，結合生物信息學和生物統計學方法，我們篩選出了在大鼠前肢爪內肌和肱二頭肌失神經萎縮后差異表達的基因;同時，我們還利用生物信息軟件尋找可能參與失神經肌萎縮的生物學通路，我們鑒別出了一些重要的信號通路，它們很可能在肌纖維萎縮過程中起到了重要的作用。通過基因芯片技術對大鼠前肢爪內肌和肱二頭肌的失神經肌萎縮

14、過程進行基因表達譜分析，發(fā)現這兩種肌肉在失神經后的存在大量表達基因和信號通路存在差異:例如前肢爪內肌中MLC、MHC基因，TGF3通路中Smad系列基因高表達;肱二頭肌中泛素蛋白酶通路的E1、E2s、E3s等基因高表達，MAPK通路中的NIK、SRF基因等高表達。
　　結論：大鼠前肢爪內肌失神經后，肌萎進程中自我調控的基因和信號通路較少;且主要以促進損傷、凋亡，抑制修復、再生為主。肱二頭肌失神經后，肌萎進程中自我調控的基因和信號通