加味小柴胡湯的抗急性肝細(xì)胞損傷作用及其機(jī)理研究.pdf

1、研究意義與目的: 肝細(xì)胞損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理變化，其長(zhǎng)期存在往往是導(dǎo)致肝纖維化，甚至是肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素。因此防治肝細(xì)胞損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一。肝細(xì)胞損傷機(jī)制復(fù)雜，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)肝細(xì)胞損傷的認(rèn)識(shí)已進(jìn)入到細(xì)胞分子水平，對(duì)中醫(yī)防治肝細(xì)胞損傷作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)也由保護(hù)肝細(xì)胞膜、降低轉(zhuǎn)氨酶等淺層面逐漸深入。肝細(xì)胞損傷是一種由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜的生物學(xué)過程，損傷的結(jié)果是肝細(xì)胞可能發(fā)生凋亡或壞死。近年

2、來的研究表明，相比其他機(jī)制來講，細(xì)胞凋亡在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮著更為重要的作用。Caspase(半胱天冬酶)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是當(dāng)前肝細(xì)胞損傷凋亡機(jī)理研究當(dāng)中的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容，而中醫(yī)藥在此方向的研究較為分散，尚未形成體系。 小柴胡湯出自《傷寒論》，在長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐中，廣泛用于肝膽、消化、免疫等系統(tǒng)疾病的治療。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為引起肝細(xì)胞損傷的病因多為感受時(shí)邪，或飲酒過度，或情志失調(diào)，或久病體虛等，脾虛、陰虛及瘀血是其常見的病理改變，但小柴胡湯

3、中健脾、養(yǎng)陰及活血的藥力卻顯不足。依據(jù)導(dǎo)師的臨床經(jīng)驗(yàn)，本課題在原方基礎(chǔ)上加入茯苓、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、丹參等健脾、養(yǎng)陰及活血中藥構(gòu)成加味小柴胡湯。根據(jù)中醫(yī)防治肝細(xì)胞損傷作用機(jī)制研究趨勢(shì)，通過觀察加味小柴胡湯對(duì)刀豆蛋白A、D-氨基半乳糖所致急性肝損傷模型的影響，評(píng)價(jià)與比較加味小柴胡湯的抗肝細(xì)胞損傷作用，并通過對(duì)信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因及其表達(dá)的檢測(cè)，探索加味小柴胡湯對(duì)小鼠肝細(xì)胞損傷中肝細(xì)胞凋亡信號(hào)通路調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。 方法: 1

4、.兩種小柴胡湯急性毒性實(shí)驗(yàn)(改進(jìn)寇氏法)：NIH小鼠隨機(jī)分為小柴胡湯80g/kg/d組、40g/kg/d組、20g/kg/d組、10g/kg/d組，加味小柴胡湯80g/kg/d組、40g/kg/d組、20g/kg/d組、10g/kg/d組，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。加味小柴胡湯組及小柴胡湯組均按80、40、20、10g/kg/d的劑量配制給藥，正常對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。給藥后觀察5天，逐日記錄中毒癥狀、死亡情況，死亡動(dòng)物及時(shí)尸解，記錄病變情

5、況，若肉眼可見病變組織時(shí)，進(jìn)行該組織的病理形態(tài)學(xué)檢查。通過上述實(shí)驗(yàn)的觀察，以測(cè)定不同濃度的加味小柴胡湯及小柴胡湯對(duì)小鼠的毒副作用，從而確定試驗(yàn)的劑量范圍。 2.兩種小柴胡湯對(duì)刀豆蛋白A所致急性肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：將NIH雄性小鼠分為加味小柴胡湯大、中、小劑量組、正常組、聯(lián)苯雙酯組、模型組及小柴胡湯組。分別于首日上、下午和次日下午按加味小柴胡湯40、20、10g/kg/d，小柴胡湯40g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d劑

6、量灌胃給藥，正常組和模型組給予生理鹽水。末次給藥后4h，除正常組，其余各組小鼠均一次性尾靜脈注射ConA 20mg/kg，禁食，不禁水，建立ConA致小鼠急性肝細(xì)胞損傷的動(dòng)物模型。8h后摘小鼠眼球取血，不抗凝取血清。血清獲取后分為兩部分，分別置于-20℃和-70℃冰箱中保存。取肝左葉組織，10％甲醛溶液固定。通過對(duì)肝細(xì)胞損傷小鼠的ALT、AST、腫瘤壞死因子(TNF-α)、小鼠干擾素γ(IFN-γ)，以及對(duì)肝組織的病理學(xué)檢查，探討及比較

7、兩種小柴胡湯可能的保肝降酶、TNF-α、IFN-γ含量的改變、防止肝細(xì)胞損傷的作用和機(jī)理所在。 3.加味小柴胡湯對(duì)D-氨基半乳糖所致急性肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：將NIH小鼠60只分為正常組、模型組、加味小柴胡湯大、中、小劑量組及聯(lián)苯雙酯組。分別給小鼠以加味小柴胡湯40、20、10g/kg/d，聯(lián)苯雙酯150mg/kg/d灌胃，正常組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，共7天，第6天，模型組和治療組按0.5g/kg劑量腹腔注射D-氨基半乳

8、糖，建立D-氨基半乳糖致小鼠急性肝細(xì)胞損傷的動(dòng)物模型，正常組同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水。腹腔注射24h后，摘眼球取血，分離血清。小鼠處死后，迅速取出肝臟，10％甲醛溶液固定。通過對(duì)肝細(xì)胞損傷小鼠的ALT、AST、SOD、MDA、NO，半定量RT-PCR法檢測(cè)Fas及FasL基因mRNA表達(dá)以及肝組織病理檢查等指標(biāo)的檢測(cè)，探討加味小柴胡湯的保肝降酶、抗氧化、防止肝細(xì)胞損傷及肝細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)理所在。 結(jié)論: 1.加味小柴