鼠尾草酸聯合三氧化二砷誘導白血病細胞凋亡的體內體外研究.pdf

1、目的：急性髓系白血病(AML)是一種造血系統(tǒng)細胞異常增殖的惡性血液腫瘤。其發(fā)生和發(fā)展與白血病細胞凋亡異常密切相關。細胞具有增殖、分化和凋亡三方面的特征，在維持正常組織的生長平衡過程中三者互相協(xié)調、共同調節(jié)。一旦細胞凋亡受阻，打破細胞的平衡調節(jié)，造成明顯的生長優(yōu)勢，就為腫瘤的發(fā)生奠定基礎。因此誘導凋亡療法是目前治療白血病的最重要方法之一.三氧化二砷(As2O3)作為經典的凋亡誘導劑，不僅可使初治的APL患者有較高完全緩解率，對全反式維甲酸

2、和化療耐受的復發(fā)患者及其他類型的白血病也有良好的治療作用，并且不會導致骨髓抑制。但是其毒副作用在一定程度上限制了AS2O3在臨床的應用。有研究表明As2O3的毒性呈劑量依賴性，因此，尋找少毒副作用增敏劑，與As2O3聯合應用，增強其誘導凋亡的作用，降低其使用劑量，減輕其毒副作用，是拓寬As2O3臨床應用范圍的重要手段。鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)是迷迭香提取物中的抗氧化多酚，作為無毒防腐添加劑，廣泛應用于食品加工行業(yè)。研

3、究發(fā)現CA具有多種藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗血栓、抗炎等。近年來，最新研究證實CA能夠增強全反式維甲酸和維生素D衍生物誘導白血病細胞分化的能力CA在體內和體外是否具有誘導白血病細胞凋亡的能力?CA與As2O3聯合是否具有協(xié)同作用?其內在的分子機制又是什么?針對上述問題，本實驗著重探討CA自身及聯合As2O3誘導HL-60細胞(人急性髓系白血病細胞株)及人白血病小鼠模型體內白血病細胞凋亡的作用，并采用各種分子生物學技術，研究其內在的分

4、子機制。 方法：1、體外實驗：選用人急性髓系白血病細胞株HL-60細胞為研究對象，CA自身及聯合As2O3作用，采用臺盼藍染色，細胞計數儀計數，觀察藥物對細胞生長情況的影響；用MTT法檢測細胞活性的改變；瑞氏一吉姆薩染色觀察藥物作用后細胞形態(tài)學改變；碘化丙錠(PI)染色，流式細胞術分析細胞周期改變；AnnexinV/FITC和PI染色計算細胞凋亡率；應用Western blot檢測細胞周期、細胞凋亡及信號轉導途徑的相關蛋白cas

5、pase-9、BAD、p-BAD、p27、PTEN、Akt、p-Akt的表達；采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測PTEN mRNA的表達。 2、體內實驗：(1)HL-60/SCID小鼠動物模型的建立及鑒定：選取5周齡的聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，鼠尾靜脈注射對數生長期的HL-60細胞1×107個，建立HL-60/SCID小鼠人白血病模型。觀察小鼠的一般情況及生存時間；每周檢查血常規(guī)，進行白細胞計數及血涂片檢測：取

6、瀕死小鼠的腦、肝、脾、腎、骨髓及淋巴結腫塊，進行組織病理學及細胞學檢測；取瀕死小鼠的骨髓細胞制成染色體標本，應用G顯帶法進行染色體核型分析。(2)劑量-效應實驗：取接種1周后的SCID小鼠，隨機分為3組，每天分別給與CA 200mg/Kg、300mg/Kg、500mg/Kg，i.g.，治療4周后記錄生存時間。(3)CA自身及與As2O3聯合治療HL-60/SCID小鼠的療效觀察：取接種1周后的SCID小鼠，隨機分為4組：①對照組：每日給

7、與橄欖油，i.g.+生理鹽水，i.p.；②CA組：每日給與CA 500mg/Kg，i.g.+生理鹽水，i.p.；③As2O3組：每日給與橄欖油，i.g.+.As2O,3mg/Kg，i.p.；④CA+As2O3組：每日給與CA 500mg/Kg，i.g.+As2O3 3mg/Kg，i.p.。給藥4周。觀察小鼠的一般情況及生存時間。取接種4周后的SCID小鼠，分組給藥同(3)。給藥10天后處死，取脾細胞制成單個細胞懸液，流式細胞術分析細胞周

8、期改變和檢測細胞凋亡率。取小鼠的腦、肝、脾、腎、骨髓及淋巴結腫塊，進行組織病理學及細胞學檢測，免疫組化檢測caspase-3、p27、PTEN的表達改變。 結果：1、體外實驗：臺盼藍染色，細胞計數儀計數，和MTT法示，CA對HL-60細胞生長的抑制呈劑量、時間相關性，并且CA顯著增強As2O3對HL-60細胞活性的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下觀察可見治療組細胞有凋亡現象出現。單用CA組、A

9、s2O3組和CM+As2O3組作用48h后，處于G1期的細胞百分率(％)分別為：49.69±2.66、52.93±2.18和77.59±1.40，CA顯著增強As2O3引起的細胞G1期停滯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Westrenblot示，與細胞周期改變一致，聯合用藥組p27蛋白表達明顯高于單藥組。表明p27參與了以上藥物引起的G1期停滯。Annexin V-FITC/PI染色法顯示加入15 μ M CA，使得凋亡率(％)從A

10、s2O3組的42.35±2.51上升到CA+As2O3組的75.5±2.45，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明CA能夠誘導HL-60細胞凋亡，其作用隨著濃度的增加而增強；并且能夠加強As2O3誘導凋亡的作用。Westren blot示48h后，cleaved caspase-9在15μM CA組，4μM AszO3組和15μM CA+4μMAs2O3組的表達依次增強，均強于對照組；BAD的表達沒有明顯變化；p-BAD的表達依次減弱

11、，均弱于對照組。說明藥物誘導凋亡的作用與激活caspase-9，抑制BAD磷酸化有關。PTEN蛋白和mRNA的表達在15 μM CA組，4 μM As2O3組和15μM CA+4μM As2O3組依次增強，均強于對照組。Akt在15μM CA組，4μM As2O3組和15 μM CA+4μM As2O3組的表達沒有明顯變化；p-Akt的表達依次減弱，均弱于對照組。提示CA、As2O3能夠促進PTEN的表達，抑制Akt的磷酸化。 2、體內

12、實驗：(1)HL-60/SCID小鼠動物模型的建立及鑒定：接種后14天外周血涂片可見HL-60細胞，發(fā)病晚期瀕死小鼠白細胞計數數倍于正常，血涂片中HL-60細胞可占90％。白細胞計數第14、21、和28天WBC(109/L)分別為3.9±1.2、5.4±0.7和16.1±3.9。生存期為24-32天。取瀕死小鼠解剖后，可見肝、脾、腎、睪丸腫大，并且肝、脾、腎及腹膜彌漫存在粟粒樣白色結節(jié)(白血病細胞浸潤)，頸項、四肢、眼、淋巴結可見腫塊。

13、腦、肝、脾、腎、骨髓及淋巴結腫塊組織病理切片和細胞涂片顯示有大量白血病細胞浸潤。染色體核型分析示動物體內白血病細胞與體外培養(yǎng)的HL-60細胞染色體核型一致。(2)劑量-效應實驗：經過4周治療后，生存期(天)分別為：200mg/Kg：34.9±3.28，300mg/Kg42.6±5.82，500mg/Kg：47.0±6.17，提示小鼠生存期呈劑量相關性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(3)CA自身及與As2O3聯合治療HL-60/SC

14、ID小鼠的療效觀察：經過4周治療后，生存期(天)分別為：對照組：27.0±2.49，CA組：50.8±3.12，As2O3組：62.2±2.66，CA+As2O3。組：80.1±5.02，提示與單藥相比，CA和As2O3聯合生存期明顯延長(P＜0.05)。流式細胞術分析細胞停滯在G1期的細胞百分率(％)為：對照組：36.0±4.53，CA組：46.4±6.47，As2O3組：51.0±3.54，CA+As2O3組：75.2±8.53，說

15、明CA顯著增強As2O3引起的細胞G1期停滯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。流式細胞術分析藥物引起的細胞凋亡率(％)分別為：對照組：4.8±1.79，CA組：13.2±3.19，As2O3組：58.2±5.97，CA+As2O3組：76.2±4.87，CA能夠促進As2O3誘導凋亡的能力(P＜0.05)。組織病理切片和細胞涂片示：對照組可見大量的白血病細胞成團聚集，治療組均可見不同數量的凋亡的白血病細胞。免疫組化示：聯合用藥組cas

16、pase-3、p27、PTEN的表達均高于單藥組。 結論：CA在體外實驗中能夠抑制HL-60細胞的增殖，具有一定的誘導細胞凋亡和細胞周期停滯的能力，并且呈時間、劑量依賴性。在體內實驗中，CA亦能引起HL-60細胞凋亡，并能夠延長白血病小鼠的生存時間，呈劑量依賴性。更為重要的是，CA與As2O3聯合應用，不但能夠在體外顯著增加白血病細胞的凋亡率，引起細胞周期阻滯于G1期，并且在體內也能顯著增強上述作用，并能顯著延長小鼠生存時間。其

17、協(xié)同效果明顯高于單藥組。 在誘導凋亡作用機制的研究中，我們發(fā)現CA自身及聯合As2O3，在體外能促進p27的表達，激活caspase-9，抑制BAD的磷酸化。且PTEN/Akt信號通路亦參與了各藥物誘導的細胞凋亡和細胞周期的停滯。在體內研究中，CA自身及聯合As2O3能夠活化caspase-3，增強PTEN、p27的表達。 綜上所述，體內、體外實驗證明CA能夠增強As2O3抗白血病的作用，使得應用較小劑量的As2O3就能