cAMP信號通路介導全麻藥遺忘和睡眠損害效應.pdf

1、環(huán)磷酸腺苷(cAMP或cyclic AMP，3'-5'-cyclic adenosine monophosphate)作為胞內第二信使，主要負責傳遞G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR，G-protein coupled receptor)信號。cAM由腺苷酸環(huán)化酶(AC，adenylyl cyclase)分解ATP產(chǎn)生，通過磷酸二酯酶（PDE，phosphodiesterase）降解。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，cAMP能夠通過蛋白激酶A（PKA，prote

2、in kinase A）-cAMP反應元件結合蛋白（CREB，cAMP responseelement-binding protein）、環(huán)核苷酸控制的離子通道（CGN channels，cyclicnucleotide-gated channels，特別是超極化激活的CGN通道(HCN通道，hyperpolarization-activated CGN channels)）和cAMP活化的交換蛋白(Epac，exchangeprote

3、in directly activated by cAMP)等信號通路，參與學習記憶、睡眠和晝夜節(jié)律調控等多種功能。靜脈全麻藥異丙酚和吸入性全麻藥異氟烷和七氟烷均能夠調節(jié)中樞和外周GPCR/G蛋白/cAMP信號通路。本課題擬研究調控腦cAMP信號通路對全麻藥導致的遺忘和睡眠損害效應的影響。
　　 第一部分cAMP/CREB通路介導異丙酚對空間記憶鞏固的損害
　　 目的:靜脈全麻藥異丙酚(propofol)在低于麻醉濃度時

4、，即可損害情景記憶的鞏固,導致順行性遺忘，而對記憶編碼和短時記憶無明顯影響。情景記憶為人類獨有，包含了事件(what)、時間(when)、地點(where)、情緒(emotion)和背景環(huán)境(context)等要素。大鼠空間記憶模型(Morris水迷宮，non-cued MWM)能夠模擬情景記憶的事件和地點要素，被稱為“類情景記憶”(episodic-like memory)。本研究假設一:與臨床研究相似，鎮(zhèn)靜劑量的異丙酚能夠選擇性損害

5、大鼠空間記憶鞏固，而對空間學習和短時記憶無影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠空間記憶的鞏固依賴于海馬cAMP/CREB信使系統(tǒng)。假設二:異丙酚損害空間記憶鞏固的同時，抑制了海馬cAMP/CREB通路。假設三:選擇性磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制劑rolipram能夠通過抵消異丙酚對cAMP/CREB通路的抑制，逆轉異丙酚的遺忘效應。
　　 方法:實驗分為四組:C（賦形劑對照組）;P（異丙酚組，25 mg/kg，腹腔注射）;R(rolip

6、ram組，0.3 mg/kg，腹腔注射);R+P(rolipram聯(lián)合異丙酚組，異丙酚注射前25分鐘注射rolipram)。實驗一:為排除異丙酚和rolipram的鎮(zhèn)靜效應對異丙酚遺忘的影響，分別在異丙酚注射后5、15和25分鐘測定了大鼠的鎮(zhèn)靜/麻醉評分。實驗二:為排除運動能力對異丙酚遺忘的影響，分別在異丙酚注射后5、15和25分鐘，采用轉棒實驗測定了大鼠的運動技巧和協(xié)調能力。實驗三:為排除非空間因素（運動能力、恐懼感、工作記憶等）對大

7、鼠空間記憶和異丙酚遺忘的影響，在異丙酚注射后5分鐘和24小時實施顯露平臺的水迷宮實驗(cued MWM)。實驗四:空間學習記憶實驗(non-cued MWM)和cAMP/CREB通路活化情況測定。在異丙酚注射后5分鐘行定位航行訓練（隱藏平臺實驗），測定空間學習和短時空間記憶情況;在異丙酚注射后24小時，行空間探索實驗，測定長時間記憶水平，以反映空間記憶鞏固情況。在異丙酚注射后5分鐘、50分鐘和24小時測定海馬cAMP/CREB通路活化情

8、況，包括cAMP水平;ERK1/2、AKT、CaMKⅡα和CREB磷酸化活化程度;CaMKIV、BDNF、c-Fos和Arc蛋白表達水平。
　　 結果:實驗一:與對照組相比，異丙酚25 mg/kg注射后，大鼠表現(xiàn)出部分鎮(zhèn)靜效應。rolipram預注射對異丙酚的鎮(zhèn)靜效應無影響。實驗二:異丙酚和rolipram均不損害大鼠的運動能力。實驗三:異丙酚對非空間記憶無影響。異丙酚注射后5分鐘和24小時的顯露平臺實驗中，各組大鼠潛伏期無統(tǒng)計

9、學差異。實驗四:異丙酚不損害空間學習和短時記憶能力，但損害空間記憶鞏固。預先注射rolipram能夠對抗異丙酚的遺忘效應。與對照組相比，異丙酚注射后海馬cAMP水平降低，CREB和CaMKⅡα磷酸化水平降低，BDNF、Arc蛋白表達下降。單獨注射rolipram增加cAMP水平，但對空間記憶和其他信號通路無影響。預先注射rolipram能夠對抗異丙酚對cAMP/CREB通路的抑制。
　　 結論:異丙酚選擇性損害空間記憶鞏固，導致

10、順行性遺忘。cAMP/CREB通路可能介導了異丙酚的遺忘效應。
　　 第二部分RGS/Gα12/cAMP通路介導吸入性全麻藥對睡眠的損害
　　 目的:術后睡眠障礙的發(fā)生率約為100％，主要表現(xiàn)為清醒次數(shù)增加，NREM睡眠時間減少，REM睡眠時間先抑制后反跳性增加，且伴隨有嚴重的晝夜節(jié)律紊亂。術后睡眠障礙嚴重影響手術療效，增加術后并發(fā)癥和死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，全麻藥可能是術后睡眠障礙的獨立危險因素。不同于異丙酚，吸入性麻醉藥麻

11、醉后，小鼠REM睡眠反跳性增加。研究全麻藥導致睡眠障礙的相關機制，并探索相關的有效干預措施，可能有助于改善患者術后預后。不同于靜脈麻醉藥，異氟烷和七氟烷能夠作用于Gαi2/cAMP通路。RGS蛋白(regulators ofG protein signaling protein)作為GPCR信號通路的負向調節(jié)因子，能夠通過加速降解GTP，抑制Gαi2/cAMP通路。此前研究發(fā)現(xiàn)RGS蛋白失敏感的Gαi2G184s小鼠對異氟烷更加敏感。異

12、氟烷麻醉后，該基因敲入小鼠翻正反射消失的時間縮短，恢復時間延長。本研究進一步假設一:RGS蛋白對Gαi2/cAMP通路的抑制有助于維持正常的睡眠結構;假設二:RGS蛋白對Gαi2/cAMP通路的抑制參與了吸入麻醉導致的睡眠障礙。
　　 方法:研究采用了基因敲入(gene knock-in)的Gαi2G184s小鼠。該小鼠Gαi2蛋白第184位甘氨酸殘基(G)被突變?yōu)榻z氨酸殘基(S)后，失去與RGS蛋白結合的能力，導致RGS蛋白催

13、化活化型GTP-Gαi2轉變?yōu)榉腔罨虶DP-Gαi2的作用消失，即RGS失敏感的Gαi2亞單位G184S等位基因突變(RGS-insensitive G184S Gαi2 allele mutation)。Gαi2G184s基因敲入小鼠的Gαi2相關信號通路增強，即Gαi2持續(xù)抑制cAMP水平和Gβγ信號通路持續(xù)活化。實驗一測定了野生型(WT)、雜合子Gαi2G184S基因敲入小鼠(+/GS)和純合子基因敲入小鼠(GS/GS)的24小

14、時基礎睡眠結構，以確定RGS/Gαi2相互作用在維持正常睡眠中的作用。實驗二觀察給予3小時異氟烷(1.3％)或七氟烷(2.8％)麻醉后18.5小時內，三種基因型小鼠的睡眠結構損害情況，以確定RGS/Gαi2是否參與了吸入性麻醉藥導致的睡眠紊亂。
　　 結果:實驗一:WT小鼠和+/GS小鼠在24小時覺醒時間、NREM睡眠時間和REM睡眠時間無統(tǒng)計學差異。與WT小鼠相比，純合子GS/GS小鼠24小時NREM睡眠時間增加了13.95％

15、，而覺醒時間減少了11.85％。WT和GS/GS小鼠的覺醒/睡眠時間比例也不相同。與WT小鼠相比，GS/GS小鼠白晝時NREM睡眠和REM睡眠減少，而夜晚時NREM睡眠和REM睡眠增加。同時，GS/GS小鼠的NREM睡眠和覺醒維持存在障礙，表現(xiàn)為NREM睡眠和覺醒次數(shù)增加而平均每次持續(xù)時間下降。FFT功率密度譜分析發(fā)現(xiàn)，GS/GS小鼠覺醒和NREM睡眠期delta活動(0.5-4 Hz)增加，而REM睡眠期theta活動(5-8 Hz)

16、減少。以上結果提示RGS/Gαi2參與了小鼠正常睡眠結構的維持。實驗二:與對照組（純氧組）相比，異氟烷或七氟烷麻醉導致了深度睡眠結構紊亂，主要表現(xiàn)為覺醒時間先增加后減少，NREM睡眠時間先減少后增加和REM睡眠反跳性增加。異氟烷或七氟烷麻醉時，WT小鼠恢復正常睡眠所需時間長于GS/GS小鼠。NREM睡眠期delta活動減少僅發(fā)生于WT和+/GS小鼠，而非GS/GS小鼠。以上結果提示RGS/Gαi2參與了吸入性全麻藥導致的睡眠結構損害。<