TGF-β1在三氧化二砷誘導K562細胞分化中的作用與分子機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 上世紀70年代末，上海血研所王振義教授率先應用全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)誘導分化治療急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocyticleukemia，APL)獲得成功。使APL由預后極差的一類白血病亞型轉變?yōu)榭赡苤斡募膊。蔀槟[瘤誘導分化治療中最為成功的范例[1]。但是隨后發(fā)現(xiàn)單一應用ATRA治療APL存在的一些不足：如治療過程易出現(xiàn)維甲酸綜合征(RAS

2、)、耐藥及緩解后復發(fā)率高等。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)作為傳統(tǒng)中藥砒霜的主要有效成分，我國傳統(tǒng)中醫(yī)很早就對其性質做了描述，數(shù)百年前即有應用砷化物用于治療腫瘤的記載。1992年哈醫(yī)大一附院開始單一應用As2O3治療APL取得了顯著的臨床效果，完全緩解率(CR)達65％-98％[2]。并且對ATRA耐藥及復發(fā)的APL患者同樣具有很好的治療效果，目前As2O3已廣泛應用于血液系統(tǒng)腫瘤的臨床治療。ATRA聯(lián)合As

3、2O3,已成為APL治療的標準方案之一。研究表明As2O3對急性白血病細胞作用與藥物濃度相關：高濃度時主要促進腫瘤細胞凋亡，低濃度時則以誘導腫瘤細胞分化為主，這一特性在APL細胞中最為明顯。體外實驗也證實As2O3對早幼粒白血病細胞株NB4細胞表現(xiàn)出劑量依賴的雙重作用：高濃度觸發(fā)細胞凋亡，可能與As2O3損害線粒體功能，激活細胞凋亡蛋白酶有關；而在低濃度可以誘導細胞部分分化，其機制可能與降解PML-RARα融合蛋白，恢復維甲酸信號通路有

4、關[3]。
　　 隨著研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)砷劑對其他類型白血病細胞株及實體腫瘤細胞亦具有廣泛的抑制增殖，誘導凋亡的作用。提示維甲酸受體通路并非砷劑誘導細胞凋亡的惟一通路，可能存在其他信號通路。同時盡管As2O3在白血病的臨床治療中已取得明顯效果，但是在誘導分化治療紅白血病方面研究進展相對緩慢。在此情況下我們通過建立As2O3誘導紅白血病細胞系K562分化模型來進一步探討As2O3誘導K562細胞分化的作用機制，以探索其抗

5、腫瘤機制中的作用靶點。為以后通過與相關靶向藥物聯(lián)合應用治療紅白血病，以達到更好的治療效果提供實驗依據(jù)。實驗目的
　　 As2O3作為一種誘導分化藥物，其對APL的治療取得顯著療效，但是在誘導分化治療紅白血病方面進展相對緩慢。在這種情況下，我們通過建立小劑量As2O3誘導紅白血病細胞系K562分化模型，研究wilms瘤基因(wilms'tumor gene，WT1)、轉化生長因子-beta1(transforming growth

6、 factor-β1，TGF-β1)在誘導分化過程中的變化及其調控關系。初步探討As2O3誘導K562細胞分化的分子學機制。為以后探索其抗腫瘤機制中的作用靶點，聯(lián)合作用于相關靶點的靶向藥物，以達到更好的治療效果提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 首先建立小劑量As2O3(1.0μmol/L)誘導K562細胞分化模型，然后油境下觀察K562細胞形態(tài)變化；應用MTT實驗方法測定As2O3對細胞增殖的影響，流式細胞術分析細

7、胞周期；RT-PCR方法檢測EVI1及WT1，TGF-β1在mRNA水平的表達的變化。采用基因沉默技術干擾WT1及早期生長反應基因(early growth response1，EGRl)的表達，觀察下游基因TGF-β1的變化。
　　 實驗結果：
　　 1.0μmol/L As2O3對K562細胞誘導72h后，可觀察到G0/G1期細胞所占百分比值升高，G2/M期細胞百分比數(shù)值下降；1.0μmol/L As2O3處理K56

8、2細胞0h、24h、48h、72h后EVI1及WT1表達降低，條帶逐漸變暗，TGF-β1表達升高，條帶逐漸變亮。WT1基因沉默后TGF-β1表達升高，條帶逐漸變亮。而EGR1基因沉默后TGF-β1表達未受影響，條帶亮度無明顯變化。其具體分子機制有待進一步研究。結論
　　 小劑量As2O3對K562細胞的誘導分化效應與EVI1和WT1基因表達下調，TGF-β1基因表達上調有關。應用WT1siRNA干擾K562細胞WT1基因表達后可