規(guī)模化牧場布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查與iELISA檢測方法的建立.pdf

1、目前我國布魯氏菌病主要的診斷方法為細(xì)菌分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測，但滿足不了快速檢測和大群檢測的要求，且容易出現(xiàn)假陽性。為了更好的診斷和預(yù)防布魯氏菌病，需要研究新型的檢測方法來滿足快速和大群檢測的要求。
　　1.自2013年1月-2014年12月，本實(shí)驗室用虎紅平板凝集試驗的方法對送檢和采集的疑似布魯氏菌病奶牛血清樣本進(jìn)行了檢測，初步篩查了奶牛場布魯氏菌病的流行情況。共計檢測奶牛血清樣本數(shù)為8160份，其中陽性血清樣數(shù)本為1768份，占

2、檢測總樣本數(shù)的21.67％。流產(chǎn)檢測的奶牛血清樣本數(shù)為898份，其中陽性血清樣本數(shù)為400份，占流產(chǎn)檢測總樣本數(shù)的44.54％;大群檢測的奶牛血清樣本數(shù)為7262份，其中陽性血清樣本數(shù)為1368份，占大群檢測總樣本數(shù)的18.84％。
　　2.布魯氏菌外膜蛋白OMP16有良好的免疫原性，是亞單位疫苗的熱門候選。T4SS是布魯氏菌的胞內(nèi)寄生所必須的毒力因子。2011年，Marchesini MI等利用CyaA報告系統(tǒng)鑒定BPE123、

3、BPE275、BPE005和BPE043是由T4SS分泌的效應(yīng)蛋白。它們在布魯氏菌胞內(nèi)運(yùn)輸過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其是否具有良好的免疫原性還沒有被證明。因此，本試驗挑選了OMP16和BPE123兩個基因，純化其重組蛋白，嘗試建立間接ELISA檢測方法。
　　據(jù)GenBank中布魯氏菌OMP16和BPE123的基因序列，設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增OMP16和BPE123基因片段。用OMP16和BPE123基因構(gòu)建克隆質(zhì)粒，同時進(jìn)行雙酶切

4、和測序鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pET-T3-OMP16和pET-T3-BPE123。同時對克隆質(zhì)粒pET-T3-OMP16、pET-T3-BPE123和pET-32a(+)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切?；厥漳康幕蚱蜲MP16、BPE123以及pET-32a(+)線性片段，用連接酶將它們連接，構(gòu)建陽性表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-OMP16和pET-32a-BPE123。隨后將二者轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中，構(gòu)建表達(dá)菌pET-32a-OMP16-BL21和pE

5、T-32a-BPE123-BL21。用IPTG誘導(dǎo)構(gòu)建的表達(dá)菌進(jìn)行表達(dá)，并對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。利用SDS-PAGE和Western-blot分析鑒定表達(dá)的蛋白。用Ni-NTASpin Kit大量純化并收集重組蛋白。以純化的蛋白OMP16和BPE123作為包被抗原，嘗試構(gòu)建iELISA檢測方法。在嘗試試驗中確定抗原的最佳包被濃度和最佳包被條件;確定二抗的最佳稀釋度以確定及陰陽性臨界值，同時確定試驗敏感性和試驗重復(fù)性。用建立的iELIS

6、A方法檢測245份奶牛血清樣本，并與虎紅平板凝集試驗作對照，判斷該方法的符合率。
　　純化了OMP16和BPE123蛋白，成功構(gòu)建以O(shè)MP16為包被抗原的iELISA檢測方法。該檢測方法與虎紅平板凝集試驗的符合率達(dá)91.38％。BPE123蛋白在嘗試建立iELISA檢測方法時，出現(xiàn)多種不能區(qū)分陰陽血清的問題，未能成功構(gòu)建BPE123蛋白的iELISA檢測方法。
　　結(jié)論:布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，布病在全國范圍內(nèi)的許多