miR-126靶向EGFL7抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、一、研究背景
　　 最新統(tǒng)計(jì)資料顯示,在歐美發(fā)達(dá)國家和我國城市中,肺癌已位居男性惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率的首位,女性惡性腫瘤發(fā)病率的第二位,死亡率的第一位。目前肺癌的發(fā)病率正呈不斷上升的趨勢(shì),其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)約占全部肺癌的80％以上。肺癌的分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),煙草或工業(yè)廢氣等環(huán)境致癌物質(zhì),可作為支氣管和肺泡上皮細(xì)胞的啟動(dòng)因子,使原癌基因如k-ras激活(稱為癌基因

2、),以及抑癌基因如p53和RB1失活,引起支氣管和肺泡上皮的增殖異常,細(xì)胞增殖和凋亡平衡紊亂,最終導(dǎo)致細(xì)胞生長調(diào)節(jié)失控而形成腫瘤。細(xì)胞增殖異常是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的重要因?yàn)?但其確切機(jī)制目前仍未完全闡明。因此,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞增殖的相關(guān)調(diào)控因子,將有助于闡明肺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。
　　 EGFL7(又名VE-statin,即類表皮生長因子域-7)是V.Mattot在2006年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)內(nèi)皮特異性基因,它在胚胎發(fā)育過程中的內(nèi)皮細(xì)胞

3、及內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá),是血管管腔發(fā)育過程中的關(guān)鍵因素,其表達(dá)降低可直接引起血管管腔的發(fā)育障礙[1]。Sharon D等[1]研究發(fā)現(xiàn)EGFL7在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)隨著缺氧條件下誘導(dǎo)的血管生成緊接著很快上調(diào),但這種增強(qiáng)的現(xiàn)象在更多的較成熟的腫瘤血管中并不持續(xù)存在,這表明其僅在血管生成的早期階段發(fā)揮作用。另外,Parker LH[2]等研究發(fā)現(xiàn),EGFL7在許多人類腫瘤中的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),包括肺腺癌、腎透明細(xì)胞癌、胃癌、前列腺癌、卵巢

4、癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤等,但在同一病人的非腫瘤組織中卻幾乎檢測(cè)不到Egf17 mRNA。因此,已有的研究表明,EGFL7對(duì)胚胎和腫瘤組織的血管生成過程可能有促進(jìn)作用,但對(duì)于肺癌細(xì)胞的增殖情況有何影響卻未見明確報(bào)道。
　　 microRNA(miRNA)是長度為18-24 nt的單鏈、非編碼核苷酸分子,具有高度的進(jìn)化保守性,與其他蛋白質(zhì)一起組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RIS

5、C)。當(dāng)RISC蛋白復(fù)合體與靶基因的信使RNA(mRNA)結(jié)合后,RISC開始切割mRNA或是阻斷mRNA的翻譯,從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。它廣泛參與動(dòng)植物生長發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖與凋亡、激素分泌及腫瘤形成等多種重要生物過程。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示每個(gè)miRNA可以調(diào)控成千數(shù)百個(gè)靶基因,這些miRNA幾乎對(duì)每一條遺傳通路都具有潛在的影響,它們調(diào)控著不同的生物過程。miRNA突變和異常表達(dá)與各種人體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,

6、miRNA可作為癌基因或抑癌基因而起作用。miRNA參與多種重要腫瘤相關(guān)基因(如miR-17/20與IL-8,miR-17-92與p21,miR-181a與Bcl-2,miR-146a.與EGFR,miR-182與RGS17,miR-199A2/214與Twist1)的表達(dá)調(diào)控,它們分別在乳腺癌、白血病、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[3-8]。已有研究顯示包括miR-126在內(nèi)的多種miRNA參與了肺發(fā)育和肺

7、癌的發(fā)病過程,小鼠和人肺發(fā)育過程中的不同發(fā)育時(shí)期miR-126等miRNA表達(dá)水平不同,miR-126表達(dá)水平隨著肺組織的發(fā)育成熟逐漸增高。
　　 為進(jìn)一步分析miR-126對(duì)Egfl7基因表達(dá)有何調(diào)節(jié)作用,我們通過生物信息學(xué)軟件(miRanda和Targetscan軟件)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-126位于EGFL7基因3’-UTR的內(nèi)含子6和7內(nèi),miR-126能與EGFL7mRNA的3’-UTR部分配對(duì),從而影響其轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程。

8、基于以上分析,本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過構(gòu)建一種靶向于EGFL7的miR-126過表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)中的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞,經(jīng)G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,然后檢測(cè)miR-126過表達(dá)對(duì)其靶基因EGFL7表達(dá)的影響,通過平板克隆增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長曲線實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等體外實(shí)驗(yàn)以及裸鼠肺癌體內(nèi)移植模型的建立等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖情況的改變情況。
　　 二、研究目的：

9、>　　 1、檢測(cè)miR-126對(duì)EGFL7的靶向作用。
　　 2、通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-126過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞的增殖情況影響。
　　 3、通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-126過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞成瘤情況的影響。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、構(gòu)建miR-126過表達(dá)質(zhì)粒,并將其和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,經(jīng)G418篩選建立兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染效率。
　　

10、 3、光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞和A549/miR-126細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后三組細(xì)胞中EGFL7及其mRNA的表達(dá)情況。
　　 5、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(包括平板克隆實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn))等方法觀察過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于A549細(xì)胞體外增殖情況的影響。
　　 6、采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染前后三組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè),分析三組細(xì)

11、胞之間細(xì)胞周期的差異。
　　 7、皮下注射轉(zhuǎn)染前后的三組細(xì)胞,建立裸鼠肺癌體內(nèi)移植模型,觀察過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞成瘤情況的影響,包括移植瘤生長曲線、瘤體體積和重量之間的比較。
　　 8、分別取三組移植瘤組織制作冰凍切片,進(jìn)行免疫組化染色,比較轉(zhuǎn)染前后三組不同移植瘤組織內(nèi)EGFL7表達(dá)變化情況。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)。各實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次,重復(fù)性好。所選圖

12、表為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之一。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析。以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四、結(jié)果
　　 1、成功建立了兩株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,包括空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染株(A549/mock組)和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染株(A549/miR-126組)。
　　 2、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn),A549/mock、A549/miR-126兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率均達(dá)90％。
　　 3、光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),A549

13、細(xì)胞與A549/mock細(xì)胞呈多邊形,而A549/miR-126細(xì)胞則呈梭形,即轉(zhuǎn)染了過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞相對(duì)于其他組細(xì)胞形狀變得較狹長。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后三組細(xì)胞內(nèi)miR-126和EGFL7mRNA量發(fā)現(xiàn),相對(duì)于A549組細(xì)胞和A549/mock組細(xì)胞,A549/miR-126組細(xì)胞內(nèi)miR-126和EGFL7mRNA含量較高。
　　 5、采用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后三組細(xì)胞

14、內(nèi)EGFL7蛋白含量發(fā)現(xiàn),與A549組細(xì)胞和A549/mock組細(xì)胞任一組進(jìn)行比較,A549/miR-126組細(xì)胞內(nèi)EGFL7含量均較高。
　　 6、對(duì)培養(yǎng)中的三組細(xì)胞,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制貼壁細(xì)胞生長曲線,結(jié)果顯示,相對(duì)于A549組細(xì)胞與A549/mock組細(xì)胞的任一組,A549/miR-126組細(xì)胞的生長速度明顯減慢。
　　 7、三組細(xì)胞的平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與A549組細(xì)胞和A549/mock組細(xì)胞任一組進(jìn)行比較,

15、A549/miR-126組細(xì)胞的增殖克隆數(shù)明顯較少。
　　 8、通過對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn),與A549組細(xì)胞和A549/mock組細(xì)胞任一組進(jìn)行比較,A549/miR-126組細(xì)胞增殖的克隆數(shù)明顯較少。
　　 9、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞的細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),與A549組和A549/mock組細(xì)胞任一組比較,A549/miR-126組的細(xì)胞S期增殖指數(shù)較低,表明miR-126過表達(dá)后,細(xì)胞的S期合成顯著減少

16、(F=60.150,P<0.001)。
　　 10、裸鼠腫瘤移植模型顯示,與A549組和A549/mock組任一組進(jìn)行比較,A549/miR-126組的瘤體體積明顯較小、瘤體重量較輕、生長速度較慢。
　　 11、對(duì)三組瘤組織制作冰凍切片并做免疫組化,結(jié)果顯示,與A549組和A549/mock組任一組進(jìn)行比較,A549/miR-126組的瘤組織中EGFL7含量較高。
　　 五、結(jié)論
　　 1、miR-126