NRK-52E缺血再灌注損傷時TLR-4表達(dá)狀況及蟲草對其干預(yù)的作用.pdf

1、第一節(jié)NRK-52E缺血再灌注損傷時TLR-4基因mRNA表達(dá)的改變 目的：通過抗霉素刺激NRK-52E細(xì)胞模擬體外缺血再灌注損傷過程，觀察缺血再灌注損傷時NRK-52E中TLR-4基因mRNA表達(dá)的變化。 方法：依據(jù)文獻(xiàn)所載的方法，將體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)予去除培養(yǎng)基后，經(jīng)10-10mol/L抗霉素(Antimycin A，AA)[14]刺激一小時后再加入培基，模擬缺血再灌注損傷過程[15]。

2、在刺激前，刺激后一小時整，加入培基再灌注10min，30min，60min，120min六個時間點(diǎn)分組，分別在不同的時間點(diǎn)終止實(shí)驗(yàn)。用流式細(xì)胞儀以Annexin V，PI染色檢測各組細(xì)胞凋亡情況；用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察各組細(xì)胞TLR-4，Bax及Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果： NRK細(xì)胞經(jīng)抗霉素A刺激一小時模擬IR損傷后，與刺激前NRK細(xì)胞相比較，其TLR-4基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，細(xì)

3、胞凋亡率顯著增高(P＜0.01)，前凋亡基因Bax mRNA表達(dá)減弱，抑凋亡基因Bax mRNA表達(dá)增強(qiáng)，(P＜0.05)；并且隨著再灌注時間的延長，這些改變進(jìn)一步明顯。 小結(jié)經(jīng)抗霉素A刺激NRK-52E細(xì)胞后恢復(fù)培基的方法能觀察到明顯的細(xì)胞凋亡改變，成功地模擬腎小管上皮細(xì)胞體外缺血再灌注損傷過程；而在這一過程中，TLR-4基因mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)TLR-4在I/R誘導(dǎo)損傷過程中的信號介導(dǎo)作用，并提示I/R損傷中T

4、LR-4信號通路的增強(qiáng)可能通過某些下游因子啟動細(xì)胞凋亡。 第二節(jié)蟲草提取液對NRK-52E細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 目的：通過運(yùn)用冬蟲夏草提取液干預(yù)NRK-52E細(xì)胞達(dá)72h后再對細(xì)胞實(shí)施模擬I/R損傷過程，對比未予蟲草提取液干預(yù)組，觀察蟲草提取液對NRK-52E細(xì)胞I/R損傷的保護(hù)作用。 方法：在成功制備抗霉素A誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞體外缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上。予加蟲草提取液培基(40mg/L)培養(yǎng)NR

5、K細(xì)胞72h后實(shí)施IRI(方法同第一節(jié))，對比未經(jīng)干預(yù)組，觀察并對比兩組間細(xì)胞TLR-4基因表達(dá)情況以及凋亡情況(凋亡率、Bax基因、Bcl-2基因)。 結(jié)果：對比未經(jīng)蟲草干預(yù)組，經(jīng)干預(yù)后的NRK-52E細(xì)胞顯示出較為明顯的對I/R損傷的耐受性。表現(xiàn)為TLR-4表達(dá)的減輕(P<0.05)，以及凋亡率的減輕，Bcl-2表達(dá)的增加，Bax表達(dá)的減輕(P<0.05)。 小結(jié)冬蟲夏草提取液可能具有通過減輕Bax的上調(diào)和Bcl-2

6、的下調(diào)程度保護(hù)I/R中的NRK細(xì)胞，減輕凋亡；并可能通過減輕TLR-4的上調(diào)產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用。 結(jié)論： 1.經(jīng)抗霉素A刺激后再恢復(fù)培養(yǎng)基灌注的NRK-52E細(xì)胞可產(chǎn)生明顯的類似于缺血再灌注的乏氧性損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡率增加，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)降低。 2.TLR-4可能參與了NRK-52E缺血再灌注損傷過程中的信號傳導(dǎo)。 3.冬蟲夏草提取液可能具有通過減輕Bax的上調(diào)和Bcl-2的下調(diào)程度保護(hù)V