葛根素對肺缺血再灌注損傷時細胞凋亡及相關基因的干預.pdf

1、目的：研究細胞凋亡和肺缺血再灌注損傷的關系及葛根素對凋亡及其相關基因的影響. 方法： 健康日本大耳白兔70只,隨機分為對照組(C組)、缺血再灌注1h(IRlh)組、3h(IR3h)組、5h(IR5h)組和缺血再灌注+葛根素lh(Purlh)組、3h(Pur3h)組、5h(Pur5h)組.麻醉后左側(cè)開胸,游離肺門,穿過阻斷帶,復制在體原位單肺缺血再灌注模型.C組左肺門過阻斷帶后不阻斷肺門,觀察6 h; IR組左肺門過阻斷帶

2、后阻斷肺門缺血1h,松開阻斷帶分別再灌注1h、3h、5h;Put組在缺血前5min靜脈給予葛根素(30mg/kg)(C組及IR組同時間點注射等量生理鹽水),余同IR組.實驗結(jié)束頸動脈取血檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量;取肺組織測濕/干重比(W/D);采用原位末端標記法檢測肺組織凋亡指數(shù)(AI);免疫組織化學、原位雜交測定肺組織Bc1-2、Bax及caspase-3的表達;光鏡、電鏡觀察肺組織

3、形態(tài)學結(jié)構變化,并測定肺損傷組織學定量評價指標(IQA). 結(jié)果： 1.IR各組SOD活性、NO含量明顯低于C組(均P<0.01),并隨再灌注時間的延長逐漸降低;Pur各組SOD、NO均高于IR組相同時間點(P<0.05或P<0.01). 2.IR各組MDA、W/D及IQA隨再灌注時間延長逐漸升高,且均高于C組(均P<0.01):Pur各組與對應時間點IR組相比明顯減低(均P<0.01). 3.IRlh組

4、肺組織細胞AI明顯高于C組(P<0.01),IR3h組高于IRlh組(P<0.01),但與IRSh組相比無統(tǒng)計學差異.Pur各組AI均顯著低于對應時間點IR組(P<0.01),其中以Pur3h組AI最高,且與Purlh及Pur5h相比,均有統(tǒng)計學差異(P<0.05).凋亡細胞主要為肺泡上皮細胞與血管內(nèi)皮細胞. 4.IR各組肺組織Bcl-2、Bax和caspase-3的表達較C組均明顯上調(diào)(均P<0.01).陽性細胞主要分布于血管

5、內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞及支氣管上皮細胞.再灌注期間,IR組Bax和caspase-3的表達隨時間延長逐漸增`加,Pur組與IR組相同時間點比較表達顯著下降(P<0.01或P<0.05);IR組Bcl-2隨再灌注時間延長逐漸下降,Pur各組與IR組同一時間點比較其表達明顯增加(均P<0.01);IR各組Bcl-2/Bax比值較C組下降(均P<0.01),并隨再灌注時間延長更加明顯,Pur各組與IR組同一時間點比較有所升高(均P<0.01)

6、. 5.肺組織Bcl-2蛋白與Bcl-2mRNA、Bax蛋白與Bax mRNA、caspase-3蛋白與caspase-3mRNA及Bcl-2蛋白/Bax蛋白與Bcl-2 mRNA/Bax mRNA之間分別呈顯著正相關(r分別=0.986,0.977,0.946,0.976,均P<0.01). MDA、W/D、IQA、BaxmRNA及caspase-3 mRNA與AI呈正相關(r分別=0.769,0.756,0.878,0.84

7、1,0.837,均P<0.01);SOD、N0、Bcl-2mRNA/BaxmRNA與AI呈負相關(r分別=-0.833,-0.759,-0.772,均P<0.01).此外,肺組織Bcl-2mRNA與血清NO含量之間呈負相關(r=-0.276,P<0.05), caspase-3mRNA與Bcl-2mRNA/BaxmRNA呈負相關(r=-0.128,P<0.01). 6.光鏡檢查:C組肺間質(zhì)及肺泡結(jié)構保持完整,無明顯受損,未見明顯

8、炎性細胞;IR組可見肺間質(zhì)增寬水腫,炎癥細胞浸潤,肺泡內(nèi)可見較多紅細胞滲出,損傷明顯;Pur組肺間質(zhì)水腫程度減輕,炎癥細胞浸潤減少,肺泡內(nèi)紅細胞滲出減少,肺泡較完整. 7.透射電鏡檢查:C組毛細血管,肺泡Ⅰ型,Ⅱ型上皮結(jié)構正常.IR組肺內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹,可見核染色質(zhì)聚集并靠核膜周邊分布,胞核固縮傾向,核間隙增大;Ⅰ型肺泡上皮細胞內(nèi)吞飲小泡較少,Ⅱ型肺泡上皮細胞表面微絨毛減少,線粒體腫脹,板層小體稀少,出現(xiàn)較多空泡;肺泡隔水

9、腫,肺泡隔及毛細血管內(nèi)炎癥細胞附壁,以中性粒細胞為主.Pur組肺組織損傷明顯減輕,肺血管內(nèi)皮細胞輕度腫脹,染色質(zhì)分布較均勻;Ⅰ型肺泡上皮細胞內(nèi)吞飲小泡較多,Ⅱ型肺泡上皮細胞表面微絨毛及板層小體增多;肺泡隔輕度水腫,毛細血管內(nèi)炎癥細胞減少. 結(jié)論： 1.細胞凋亡可能在肺缺血再灌注損傷中起重要作用. 2.肺缺血再灌注時caspase-3基因表達上調(diào),Bcl-2/Bax比值下降并隨時間延長而更加顯著,可能是促進肺缺血再