麻黃—附子藥對(duì)配伍化學(xué)成分及代謝組學(xué)的研究.pdf

1、藥對(duì)又稱對(duì)藥，是臨床常用的相對(duì)固定配伍形式。研究單味藥難以反映其在復(fù)方中的真實(shí)作用;而復(fù)方由于藥味多，作用關(guān)系復(fù)雜，對(duì)其研究也難以得出準(zhǔn)確結(jié)論?！八帉?duì)”作為中藥配伍中的雛形，對(duì)其研究恰好可以彌補(bǔ)上述研究的不足。因此，有必要對(duì)藥對(duì)發(fā)展的歷史進(jìn)程及近現(xiàn)代研究進(jìn)行系統(tǒng)的歸納與認(rèn)識(shí)，以便對(duì)其規(guī)律進(jìn)行更加深入的探究，科學(xué)地指導(dǎo)臨床應(yīng)用。
　　 麻黃-附子為臨床常用藥對(duì)，僅張仲景的著作中以麻黃-附子入藥的方劑就有麻黃附子細(xì)辛湯、麻黃附子甘草

2、湯、烏頭湯、麻黃附子湯。麻黃-附子在不同湯方中用藥劑量和功效均不同，本文研究的麻黃-附子藥對(duì)出自麻黃附子細(xì)辛湯。麻黃附子細(xì)辛湯主治風(fēng)寒表實(shí)兼陽(yáng)虛里熱癥。麻黃-附子一表一里、一虛一實(shí)，達(dá)到相輔相成的作用。“漢方不傳之秘在于用量”，本文設(shè)定麻黃-附子不同配伍比例，通過(guò)測(cè)定麻黃-附子不同配比中主要有效成分的含量，及通過(guò)比較麻黃-附子不同配伍水煎液中麻黃指紋成分的變化和通過(guò)比較麻黃-附子配伍對(duì)肉芽腫致大鼠亞急性炎癥模型尿液中生物標(biāo)志物的變化，從

3、體外化學(xué)和代謝組學(xué)兩方面說(shuō)明藥對(duì)配伍的規(guī)律。
　　 目的：
　　 (1)通過(guò)測(cè)定麻黃-附子不同配比中主要有效成分的含量，定量研究麻黃-附子配伍主要化學(xué)成分的變化規(guī)律。
　　 (2)通過(guò)比較麻黃-附子不同配伍水煎液中麻黃指紋成分的變化，進(jìn)一步研究配伍對(duì)其他成分影響的規(guī)律。
　　 (3)運(yùn)用代謝組學(xué)方法，通過(guò)比較麻黃-附子配伍對(duì)肉芽腫致大鼠亞急性炎癥模型尿液中生物標(biāo)志物的變化，探索配伍對(duì)代謝通路的影響。

4、>　　 方法：
　　 (1)本實(shí)驗(yàn)選取《傷寒論》麻黃附子細(xì)辛湯中麻黃、附子(6g、11g)設(shè)為麻黃-附子1∶1，依據(jù)藥對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的配比上下成倍浮動(dòng)，設(shè)計(jì)成三個(gè)配比即麻黃-附子(1∶0.5、1∶1、1∶2)。制備麻黃、附子、麻黃-附子(1∶0.5、1∶1、1∶2)和麻黃附子細(xì)辛湯煎液，采用HPLC法測(cè)定麻黃中主要有效成分去甲基偽麻黃堿(NMP)、去甲基麻黃堿(NME)、麻黃堿(E)、偽麻黃堿(PE)和甲基麻黃堿(ME)和附子中主

5、要有效成分苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的含量，比較麻黃-附子不同比例配伍前后水煎液中主要有效成分含量的變化。
　　 (2)采用HPLC通過(guò)梯度洗脫得到麻黃、附子、麻黃-附子(1∶0.5、1∶1、1∶2)及陰性對(duì)照色譜圖，用相似度軟件對(duì)麻黃色譜圖進(jìn)行分析獲得麻黃的共有模式，并確定其共有峰，通過(guò)紫外吸收色譜圖確定其共有峰的成分，比較麻黃-附子不同比例配伍水煎液對(duì)麻黃指紋成分共有峰峰面積的變化率。
　　 (3)根據(jù)麻黃-

6、附子具有抗炎作用選擇肉芽腫致大鼠亞急性炎癥模型造模，30只大鼠隨機(jī)分組共分為5組即空白組、模型組、麻黃組、附子組、麻黃-附子組，每組6只大鼠。共收集造模前和造模后6天尿液，尿液離心后進(jìn)行衍生化，采用GC/MS對(duì)大鼠尿液中代謝物進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，將所得的GC/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMS進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、扣除溶劑峰、雜質(zhì)峰的處理。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積歸一化處理，生成包括樣品名稱、歸一化峰面積的二維矩陣。利用SIMCA-P軟件對(duì)大鼠的尿液代謝物

7、譜進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，PCA直觀觀察不同組的差異;PLS-DA進(jìn)一步考察組間的區(qū)分程度，并根據(jù)代謝物的投影重要性(VIP)評(píng)價(jià)不同物質(zhì)與分類的相關(guān)性程度，以VIP值＞1的代謝物作為潛在生物標(biāo)志物。運(yùn)用SPSS13.0軟件對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物質(zhì)作為最終的生物標(biāo)志物。通過(guò)與對(duì)第3天的空白組、麻黃組、附子組、麻黃附子組與模型組分別進(jìn)行PLS-DA分析，分析具有顯著差

8、異的生物標(biāo)志物，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出內(nèi)源性標(biāo)志物，結(jié)合現(xiàn)有的知識(shí)闡明麻黃-附子配伍前后所影響的代謝通路。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與麻黃單煎液相比，麻黃-附子配伍后不同程度地影響麻黃中五種生物堿的含量，其生物堿的溶出率與附子在藥對(duì)中所占的比例有關(guān)，比例越大，溶出率越小。其中麻黃-附子1∶1、麻黃-附子1∶2組五種生物堿含量均顯著降低（P＜0.05）。水煎液中去甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿含量由高

9、到低依次為單味麻黃＞麻黃-附子1∶0.5＞麻黃-附子1∶1＞麻黃-附子1∶2。五種生物堿含量變化率:NMP為8％-40％，NME為10％-44％，E為10％-44％，PE為7％-43％，ME為10％-44％。
　　 與單味附子煎液相比，麻黃-附子配伍后附子中的苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的含量逐漸降低且跟麻黃在配伍中所占比例有關(guān)，麻黃配比越大，附子主要有效成分降低越大。其中麻黃-附子1∶1、麻黃-附子1∶2組兩種生物堿含量

10、均顯著降低(P＜0.05)。兩種生物堿的變化率為苯甲酰新烏頭原堿含量變化率為10％-27％，苯甲酰次烏頭原堿含量變化率為9％-24％。
　　 (2)麻黃單煎液共得到13個(gè)共有峰，麻黃-附子不同配伍比例不同程度地影響麻黃指紋成分的圖譜，配伍后共有峰峰面積顯著降低的為去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、11號(hào)未知峰、12號(hào)未知峰。配伍后共有峰峰面積顯著升高的為7號(hào)未知峰、8號(hào)未知峰、9號(hào)未知峰、10號(hào)未知峰。配伍后共有峰峰面

11、積有輕微影響的為去甲基偽麻黃堿、6號(hào)未知峰、13號(hào)未知峰。
　　 (3)通過(guò)空白組與模型組不同時(shí)間的大鼠尿液代謝物組進(jìn)行PCA分析得出的Score Plot顯示各組區(qū)分良好，不同時(shí)間模型組與空白組相比被分類，說(shuō)明造模成功。其中模型組從第1天逐漸遠(yuǎn)離空白組，分類趨勢(shì)越加明顯，在第3天達(dá)到最大值，造模后從第4天起內(nèi)源性產(chǎn)物的種類、濃度和相對(duì)比例有所回落，但未能與空白組重疊，表明在觀察時(shí)限內(nèi)，模型組的物質(zhì)代謝呈一定的自我調(diào)節(jié)趨勢(shì)，但不

12、能恢復(fù)至正常狀態(tài)。對(duì)第3天的空白組、麻黃組、附子組、麻黃-附子組與模型組共同進(jìn)行PCA分析，模型組位于第二象限，空白組位于第一象限，表明造模成功;給予麻黃、附子和麻黃-附子與模型組比較，區(qū)分明顯，麻黃-附子組位于第一象限，麻黃組位于第三象限，附子組位于第四象限，明顯偏離模型組，表明3個(gè)給藥組對(duì)模型均起到了干預(yù)作用;3個(gè)給藥組逐漸向空白組方向靠近，表明各給藥組按模型組隨時(shí)間的變化軌跡回歸空白組。以上PCA直觀分析表明，顯示麻黃附子組的代謝

13、狀態(tài)比麻黃組、附子組更接近空白組。
　　 對(duì)第3天的空白組、麻黃組、附子組、麻黃-附子組與模型組分別進(jìn)行PLS-DA分析，獲得了表征各給藥組與模型組差異的生物標(biāo)志物，包括有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸與胺類等?？瞻捉M與模型組行PLS-DA分析，獲得了表征模型組與空白組差異的生物標(biāo)志物，包括:水平高于空白組的正丙胺、丙酮酸、苯甲酰胺、苯乙酸、亮氨酸、月桂酸、苯丙氨酸、異丁酸、酪氨酸、色氨酸、異煙酰胺;水平低于空白組的檸檬酸、馬尿酸、異亮氨

14、酸。麻黃組生物標(biāo)志物包括:水平高于模型組的馬尿酸;水平低于模型組的纈氨酸、苯甲酰胺、苯乙酸、異丁酸、酪氨酸、色氨酸、異煙酰胺。附子組生物標(biāo)志物包括:水平高于模型組的馬尿酸、異亮氨酸;水平低于模型組的戊二酸、纈氨酸、苯甲酰胺、苯乙酸、月桂酸、苯丙氨酸、異丁酸、酪氨酸、色氨酸。麻黃附子組生物標(biāo)志物包括:水平高于模型組的檸檬酸、馬尿酸;水平低于模型組的正丙胺、丙酮酸、苯甲酰胺、苯乙酸、亮氨酸、月桂酸、辛二酸、苯丙氨酸、異丁酸、酪氨酸、色氨酸、

15、異煙酰胺。
　　 結(jié)論：
　　 (1)麻黃與附子配伍后，麻黃中各有效成分的溶出率明顯減少，其溶出率與附子在藥對(duì)中所占的比例有關(guān)，比例越大，溶出率越小;麻黃與附子配伍后，同單味附子相比，附子中各有效成分的溶出率也明顯減少，隨著附子劑量的增加，麻黃對(duì)附子的煎出量影響越大;麻黃附子配伍后對(duì)彼此有效成分的溶出有一定的抑制作用。
　　 (2)麻黃-附子配伍后對(duì)麻黃指紋成分共有峰的峰面積影響程度不同，對(duì)一些成分有增溶作用，對(duì)