羥基喜樹堿亞微乳細胞內動力學及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、本課題在前期研究基礎上，采用微射流技術制備了羥基喜樹堿(HPCT)亞微乳，對HCPT亞微乳的細胞內動力學特征、細胞器的分布規(guī)律，細胞攝取機制和體內外抗腫瘤作用進行了探討；研究了亞微乳中藥物分布和其藥物釋放，以及HCPT－SAE克服腫瘤細胞多藥耐藥作用。本研究為亞微乳成為抗腫瘤藥物載體的進一步研究開發(fā)提供了理論和實驗依據。 本課題首先建立了羥基喜樹堿的HPLC分析方法，測定其在水和正辛醇中的表觀溶解度分別為2.98和47.06μg

2、/mL，正辛醇，水中的表觀分配系數為12.62，其脂溶性比水溶性好；考察：HCPT在不同pH條件下的表觀開環(huán)平衡常數，以及其在多種油中的溶解度，為設計處方確定工藝條件及建立體內分析方法提供了依據。 本課題以注射用大豆油、大豆磷脂、十八酰胺或膽固醇和維生素E為油相，Poloxamcrl88或(和)大豆磷脂和甘油為水相，采用微射流技術制備了兩種HCPT亞微乳(HCPT-SAE和HCFT-LipoE)。HCPT亞微乳理化性質研究顯示，

3、HCPT-SAE和HCPT-LipoE經高壓滅菌后，外觀、乳滴粒徑、粒徑分布和Zeta電位均未發(fā)生顯著改變；pH值有所下降，但符合注射液質量要求;藥物含量略有下降，但仍占標示量的96％以上。HCPT亞微乳經高壓滅菌后理化性質穩(wěn)定。亞微乳中HCPT相分布研究表明，HCPT主要分布于O/W界面層構成的界面膜中，占亞微乳中藥物總量80％以上，油相(14％以上)中分布高于水相；體外釋放實驗表明，HCPT-SAE和HCPT-LipoE兩者體外釋放

4、行為相似，釋藥速度較慢，具有緩釋作用，此作用可能與藥物在乳劑中的相分配有關。穩(wěn)定性研究表明，HCPT亞微乳減慢了其在血漿和細胞培養(yǎng)液中由內酯型向羧酸鹽型的轉化速率，增加其以內酯形式存的濃度。 采用建立的細胞內．HCPT含量測定方法，研究HCPT亞微乳細胞內動力學和HCPT在細胞器的分布。攝取動力學結果表明，與對照制劑HCPT-I相比，相同藥物量HCPT亞微乳與細胞孵育后，能顯著提高細胞內和細胞核內藥物量。 細胞內消除動力

5、學研究表明，在SGC7901細胞中，HCPT-SAE和HCPT-LipoE的AUC顯著高于HCPT-I(P<0.01)，分別為HCPT-I的9.88和7.69倍；tl/2也顯著比HCPT-I延長(P<0.01)，分別為HCPT-I的1.67和2.1倍。HCPT亞微乳細胞核AUC和tl/2均顯著高于HCPT－I(P<0.01)，HCPT－SAE細胞核AUC比HCPT-LipoE高1.76倍；細胞質中兩亞微乳AUC也均顯著,高于HCPT-I

6、(P<0.01)。兩亞微乳細胞核AUC均比細胞質低。 SGC7901/CR細胞中HCPT-SAE和HCPT-LipoE的AUC顯著高于HCPT-I(P<0.01)，分別為HCPT-I的29.16和8.54倍，HCPT-SAE為HCPT-LipoE的3.4l倍；tl/2也顯著比HCPT-I長(P<0.01)，分別為HCPT-I的5.37和6.23倍。兩亞微乳細胞核AUC均顯著高于細胞質(P<0.01)，HCPT-LipoE細胞核內tl/2

7、比細胞質顯著延長(P<0.05)；HCPT-SAE組細胞核和細胞質AUC均顯著比HCPT-LipoE組高(P<0.01)，兩亞微乳細胞核tl/2無差異，而細胞質中HCPT-SAE比HCPT-LipoE顯著延長(P<0.05)。 HeLa細胞中HCPT-SAE和HCPT-LipoE的AUC顯著高于HCPT-I(P<0.01)，分別為HCPT-I的35.26和15.44倍；tl/2也顯著比HCPT-I長(P<0.05)，分別為HCP

8、T-I的1.67和1.75倍。兩亞微乳細胞核AUC均顯著高于細胞質(P<0.05)，HCPT-LipoE細胞核內tl/2比細胞質顯著延長(P<0.05)；HCPT-SAE組細胞核和細胞質AUC均顯著比HCPT-LipoE組高(P<0.01) HCPT亞微乳細胞攝取機理研究顯示，在一定濃度范圍內，細胞攝取HCPT量隨HCPT亞微乳濃度升高而增加，表現出明顯的濃度依賴性，高濃度時則表現為飽和性；細胞攝取HCPT亞微乳時呈現明顯的溫度

9、依賴性，該過程需要消耗能量；內吞抑制劑(疊氮鈉、甘露醇和氯喹)顯著降低細胞內HCPT聚積。初步證實，細胞攝取HCPT亞微乳為能量依賴性的內吞方式。 HCPT亞微乳能增強對腫瘤細胞增殖的抑制作用，抑制作用呈時間和劑量依賴性；HCPT-SAE對SGC7901、SGC7901/VCR和HeLa細胞的增殖均有較顯著的抑制作用，HCPT-LipoE和HCPT-I僅對敏感的細胞有較強抑制作用，而對耐藥細胞(SGC7901/VCR細胞)的抑制

10、作用很弱。腫瘤細胞增殖抑制、胞內藥物聚積等實驗確證，陽離子亞微乳(HcPT－sAE)可增強藥物對腫瘤細胞抑制增殖作用，克服腫瘤細胞多藥耐藥性。 體內藥動學研究結果表明，HCPT-SAE和HCPT－LipoE可以顯著延長HCPT的體內循環(huán)時間，提高血漿中藥物濃度，其消除半衰期分別為HCPT-I的5.75和3.72倍，AUC為HCPT-I的4.03和4.01倍。荷S180腫瘤小鼠體內分布研究結果表明，HCPT亞微乳可提高HCPT在腫

11、瘤內的分布，HCPT-SAE的腫瘤靶向作用最明顯，其AUC和峰濃度分別為HCPT-l組的11.57和1.9l倍。 HCPT-I的抗腫瘤活性最差，在4 mg/kg時其抑瘤率為31.03％，同劑量的HCPI-SAE和HCPT-LipoE抑瘤效率分別為90.75％和70.2l％；2 mg/kg的HCPT-SAE的抑瘤率為64.31％，為HCPT-I(4 mg/kg)的兩倍，對小鼠體重無顯著影響；腫瘤病理切片顯示，HCPT－SAE對腫瘤細胞抑制