Apmcf1基因在肝癌中的表達及其在細胞周期調節(jié)中作用機制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞肝癌(HCC)是世界范圍內發(fā)病率和死亡率都很高的惡性腫瘤之一，與世界其他國家尤其是西方國家相比，我國HCC死亡率居各國之首。近年來，雖然對HCC發(fā)病機制和治療手段的研究有了長足進步，但仍有待進一步深入和需要更多的研究突破。 Apmcf1是1999年在人乳腺癌MCF-7凋亡細胞cDNA文庫中克隆并命名的一個新基因，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，Apmcf1與鼠的信號識別微粒受體β亞基(signalrecognitionparti

2、clerecptorβ，SRβ)核酸序列93％同源，氨基酸序列有89％同源，說明Apmcf1可能是編碼人類信號識別微粒受體β亞基的基因。目前僅知道信號識別微粒受體主要與信號識別微粒蛋白(signalrecognitionparticleprotein，SRP)的SRP54亞基相互作用，轉運并定位分泌型蛋白和膜蛋白于內質網膜。在此過程中，SRβ可以錨定外膜蛋白SRα于內質網膜。另外，令人感興趣的是，Apmcf1還含有arf，ADP-rib

3、osylationfactorfamily以及SAR，Sarlp-likemembersoftheRas-familyofsmallGTPases兩個GTP酶(GTPase)結構域。而具有這種結構的分子Arf、Ras都屬于小G蛋白，一個分子量在20-40KD、氨基酸序列中含有GTP酶結構域、目前共有100多個成員的超家族。已發(fā)現(xiàn)該家族Ras、Rho等成員和細胞的增殖、分化、凋亡都密切相關。從分子結構上看Apmcf1和小G蛋白超家族關系密

4、切，因此它是否也具有調控細胞增殖和凋亡的功能是一個值得探討的問題。目前，國內外尚沒有關于Apmcf1基因功能的研究報道。 在前期實驗中，我們克隆了Apmcf1的開放讀框序列，構建了它的原核表達載體。在成功表達了它的蛋白質后，制作了抗Apmcf1的多克隆抗體并驗證了抗體的敏感性與特異性。用該抗體檢測了多組織芯片上Apmcf1的表達，發(fā)現(xiàn)它可在多種腫瘤和正常組織中表達；進一步分析了它在結腸癌(55例)、食管癌(53例)、肺癌(57例

5、)、肝癌(53例)和乳腺癌(47例)中的表達，其表達陽性率分別為80％、57％、58％、96％和34％。說明它可能和一些腫瘤的生長有潛在的聯(lián)系。在轉染其綠色熒光融合蛋白的真核表達載體pEGFP-Apmcf1后發(fā)現(xiàn)Apmcf1定位于細胞的胞漿和胞膜。 研究目的：探討Apmcf1基因在人肝癌細胞增殖和細胞周期調節(jié)中的作用及其機制，為深入認識Apmcf1基因的功能打下基礎，并期望為進一步認識肝癌的發(fā)病機制和基因治療提供理論依據。

6、 實驗方法： 1.應用RT-PCR方法對24例HCC手術標本及其癌旁肝組織和4種人肝癌細胞系(HepG2、SMMC-7721、HHCC、HCC-9724)中Apmcf1mRNA進行檢測。 2.通過脂質體介導將Apmcf1基因轉染人肝癌細胞系HHCC，建立穩(wěn)定表達Apmcf1基因的細胞模型(HHCC-Apmcf1)；運用Westernblot、RT-PCR、流式細胞分析(FCM)以及生長曲線等檢測轉染前后HHCC中Apm

7、cf1mRNA及其蛋白的表達、細胞周期和細胞生長的變化。 3.通過脂質體介導將Apmcf1基因的dsRNA真核表達載體轉染人肝癌細胞系HepG2，建立表達dsRNA的細胞模型(HepG2-pSUNeo-Apmcf1)；運用RT-PCR、Westernblot、FCM以及生長曲線等檢測轉染前后HepG2中Apmcf1mRNA及其蛋白的表達、細胞周期和細胞生長的變化。 4.以實驗2中的轉染Apmcf1前后的HHCC細胞為研究

8、對象，采用細胞周期基因芯片，探討Apmcf1基因對細胞周期相關基因表達的調節(jié)作用，為進一步認識Apmcf1在細胞周期調節(jié)中的作用機制打下基礎。5.采用GST融合蛋白pull-down實驗，尋找與Apmcf1相互作用的分子。 實驗結果： 1.Apmcf1基因在所檢測的HCC組織和人類肝癌細胞系中表達下調。 2.轉染Apmcf1基因的HHCC細胞出現(xiàn)了Apmcf1mRNA及其蛋白的表達，成功建立了穩(wěn)定表達Apmcf1

9、基因的HHCC細胞模型，該細胞模型表現(xiàn)出細胞生長受抑。 3.轉染Apmcf1基因dsRNA的HepG2細胞，Apmcf1mRNA及其蛋白表達顯著降低，成功建立了穩(wěn)定表達Apmcf1基因dsRNA的HepG2細胞模型，該細胞模型表現(xiàn)增強的增殖活性。 4.轉染Apmcf1基因前后的HHCC細胞，細胞周期基因芯片檢測結果發(fā)現(xiàn)：CDC27、CyclinB2、CyclinB1、CyclinG1、p21Waf1/CIP1等5種基因表

10、達上調3倍以上；TIMP3、DP1、UbiquitinC、p107、RAD51等5種基因表達下調3倍以上。 5.GST融合蛋白pull-down實驗：已經成功構建GST融合蛋白表達載體pGEX-4T-1-Apmcf1。 結論： 1.通過對HCC組織和人肝癌細胞系中Apmcf1mRNA的檢測，發(fā)現(xiàn)其在HCC組織的表達相對于癌旁肝組織下調，提示Apmcf1的表達可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)。 2.通過體外轉染A

11、pmcf1基因實驗，發(fā)現(xiàn)Apmcf1基因在體外可以抑制肝癌細胞增殖，此結果為Apmcf1基因可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展提供了新的證據。 3.通過體外轉染Apmcf1基因dsRNA，發(fā)現(xiàn)細胞系增殖活性增強，證實在體外通過RNAi技術可以特異敲除肝癌細胞中Apmcf1基因的表達，結果與體外轉染正義Apmcf1基因實驗結果相互印證。 4.應用細胞周期基因芯片，發(fā)現(xiàn)轉染Apmcf1基因前后的HHCC細胞，表現(xiàn)出細胞周期調節(jié)基因的表