重組溶葡萄球菌蛋白的原核表達、純化及生物學活性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(金葡菌)是社區(qū)和醫(yī)院感染的主要病原菌，由于抗生素的廣泛應用，產生了大量難治的耐藥菌群，常規(guī)抗生素對耐藥金葡菌所致的感染已經沒有治療效果，目前以萬古霉素為代表的糖肽類抗生素是治療耐藥金葡菌感染最有效的藥物，但萬古霉素毒性大，限制了其在臨床的大量使用。而且，自1996年至今，全球范圍內已報道多例對萬古霉素耐藥(VRSA)或中介耐藥(VISA)的病例。針對金葡菌日益增強的耐藥性，而抗生素療效愈來愈下降的迫切現(xiàn)狀，如何研發(fā)更有效

2、的藥物治療金葡菌感染，同時減輕藥物毒性和防止耐藥性的產生已成為抗感染治療亟待解決的問題。 溶葡萄球菌酶(lysostaphin)的發(fā)現(xiàn)給耐藥金葡菌感染的治療帶來了希望。它是從模仿葡萄球菌(staphylococctls simulans)中分離出來的一種含鋅的金屬蛋白酶，能特異性水解細菌胞壁肽聚糖交聯(lián)結構Gly五肽橋聯(lián)而產生破壁溶菌作用。由于Gly五肽橋聯(lián)結構僅大量存在于葡萄球菌細胞壁，其中又以金葡菌細胞壁中分布最廣，因此，溶葡

3、球菌酶主要對葡萄球菌，尤其對金黃色葡萄球菌有強大的殺滅作用。與抗生素干擾細菌的生長期不同，溶葡球菌酶的破壁活性不受細菌生長周期影響，對靜止和活動期葡萄球菌均有殺滅作用，而且不易產生耐藥性。這些特性使之成為國內外專家研發(fā)抗耐藥金葡菌制劑的重點目標之一。但是由于天然的溶葡萄球菌酶產量少，難以純化，限制了人們對其進行深入的研究和開發(fā)。直到20世紀90年代，隨著基因工程技術和蛋白質純化技術的發(fā)展，人們才逐漸建立了一些重組溶葡萄球菌酶的表達系統(tǒng)，

4、但是仍然存在以下問題，有待進一步優(yōu)化和完善：①表達蛋白無生物學活性或活性很低，有的重組蛋白比天然溶葡萄球菌酶活性低10-16倍：②重組蛋白的產量不理想；③蛋白純化方法煩瑣，時間長，純化過程導致重組蛋白的生物活性丟失，表達蛋白只適用于實驗室進行結晶學研究；④對表達蛋白的酶活性研究僅僅限于酶活力單位的測定；⑤溶葡萄球菌酶的空間結構和酶分子特性仍然不明確。這些問題阻礙了人們對溶葡萄球菌酶在人體內應用的安全性、有效性和穩(wěn)定性進行深入的研究，這極

5、大地限制了溶葡萄球菌酶的開發(fā)和應用。鑒于以上的問題，我們選用了目前表達重組蛋白功能最強大的pET系統(tǒng)，在大腸埃希菌中表達重組溶葡萄球菌蛋白，摸索優(yōu)化條件以提高蛋白產量，并對表達蛋白的酶活性進行了更加深入的研究，測定了其抗菌譜，比較了其與萬古霉素等臨床常用抗生素的抗菌效力，最后檢測了影響重組蛋白酶活力的因素，初步分析了其酶分子特性。 本課題研究的主要內容和結果如下： 1．構建原核表達載體和優(yōu)化表達目標蛋白：我們以pRG質粒

6、為模版，通過PCR選擇性地擴增溶葡萄球菌酶基因，雙酶切后與載體pET-42a(+)連接，構建了重組質粒，并經基因測序證實結果正確，表明原核表達載體構建成功，重組質粒命名為pET421ys。本研究選用的pET原核表達系統(tǒng)是目前在大腸埃希菌(E-coli)中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統(tǒng)，蛋白表達由宿主菌提供的T7RNA聚合酶誘導，非誘導條件下則不存在基礎轉錄，從而使克隆與表達很好的分離。本實驗目的基因克隆入載體后，重組質粒首先選用不含有

7、T7RNA聚合酶基因的宿主菌(DH5a)進行克隆，這就避免了對宿主細胞有毒的蛋白產物對質粒穩(wěn)定性的影響；完成克隆后，將其轉入染色體上帶有l(wèi)acUV5調控的T7RNA聚合酶基因的表達宿主菌BL21(DE3)plysS中，用IPTG誘導即可表達目的蛋白。本實驗需要大量的目標蛋白用于后續(xù)實驗，因此，我們對表達條件進行了優(yōu)化，摸索到的最佳表達條件為：25℃誘導6h，IPTG濃度為1mmol/L。用Bio-Rad Quantitv One軟件分析

8、，重組蛋白表達量可達到菌體總蛋白的40％，高于文獻報道的20％。目標蛋白主要以包涵體形式表達，少量為可溶性表達，這和文獻報道中均以可溶蛋白表達的結果不同，形成包涵體的原因可能是表達效率太高所致。 2．重組溶葡萄球菌蛋白的純化、復性及鑒定：本研究選用了固定化金屬離子親和層析法(IMAc)純化蛋白，它的優(yōu)點是金屬離子配基具有很好的穩(wěn)定性，吸附量大，成本低，純化時間短，但也有會發(fā)生非特異性吸附的缺點?？扇艿鞍椎募兓Ч焕硐?，純度僅為

9、80％，說明針對可溶蛋白的最佳純化方案還有待于進一步摸索。包涵體獲得了較高的純化效率，純度在95％以上，BCA法蛋白定量測得純化后可溶蛋白的濃度為1151.53 μg/ml，包涵體濃度為1869.54 μg/ml。1L菌液純化后獲得15.34mg重組蛋白，產量高于文獻報道的11mg。包涵體需要復性后才能恢復蛋白的生物學活性，本實驗選用了最常用的透析復性方法。利用免疫印跡法分析鑒定純化后蛋白，目標蛋白與抗His．Tag單克隆抗體反應，在分

10、子量約27kDa處出現(xiàn)特異表達的蛋白條帶，與預測基本一致，結果顯示成功獲得了較高純度的重組溶葡萄球菌蛋白。 3．重組溶葡萄球菌蛋白體外抗菌活性的研究：通過對重組溶葡萄球菌蛋白抗菌譜的初步測定，發(fā)現(xiàn)其對肺炎球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌等11種33株臨床分離株均沒有殺菌效力，僅對葡萄球菌有殺菌活性，但對金葡菌的殺菌活性顯著大于其它葡萄球菌。我們采用微量稀釋法測定了重組溶葡萄球菌蛋白對金葡菌的體外抗菌效力，結果證實，重組溶葡萄球菌蛋

11、白有強大的殺菌活性，不僅對金葡菌敏感株有良好的抗菌作用，對臨床上難治的MRSA的殺菌效果也非常突出，MIC在0.003～0.78 μg/ml之間，MBC在0.39～3.125 μg/ml之間。與傳統(tǒng)抗生素比較，重組蛋白的抗菌活性不僅顯著優(yōu)于新青Ⅱ和克林霉素，還優(yōu)于目前殺菌效果最好的萬古霉素。我們采用分光光度法測得重組溶葡萄球菌蛋白比活力是10150u/mg，這和文獻報道的970～11900 u/mg接近。酶活力越高，酶催化某一反應的速度

12、就越快，而比活力越高，表明酶越純，因此可以認為重組溶葡萄球菌蛋白純度高，抗菌活力強，這進一步印證了本實驗關于重組溶葡萄球菌蛋白具有強大的體外抗菌活性的研究結果。本實驗中發(fā)現(xiàn)純化后的包涵體不僅有抗菌活性，而且大于可溶蛋白的活性，復性后包涵體卻無殺菌活性。這不同于“包涵體需要復性才能恢復活性”的傳統(tǒng)理論。而最近的研究結果顯示，在包涵體中的蛋白質不全是非天然狀態(tài)，包涵體中存在的一些小分子熱激蛋白質(IbpAB)使某些較穩(wěn)定的蛋白質依然維持了原

13、有的立體結構和活性。本研究的結果也推測，包涵體并不全是因錯誤折疊形成的無用的副產物，仍然有一些包涵體蛋白具有天然的結構和活性。包涵體復性后無抗菌活性的問題可能是未摸索出包涵體復性的最佳條件，由于純化后的包涵體已有良好的生物學活性，因此我們將在以后的實驗中繼續(xù)摸索包涵體的最佳復性條件。 4．影響重組溶葡萄球菌蛋白活力因素的檢測：目前應用基因工程技術表達生物活性多肽的一個重要問題，就是表達肽的穩(wěn)定性，即在酸、堿環(huán)境，溫度等條件變化時

14、，表達肽是否仍能夠保持良好的生物活性。我們分析了pH值、底物濃度、孵育溫度和作用時間這四個因素對重組溶葡萄球菌蛋白活力的影響。實驗發(fā)現(xiàn)重組溶葡萄球菌蛋白的最適pH值為3～4，在pH值為3～6時，酶活力比較穩(wěn)定，說明重組溶葡萄球菌蛋白耐酸性能好。重組蛋白的最適溫度為50℃，和文獻報道的45～48℃接近。重組蛋白的酶活力還隨著底物濃度的增加和作用時間的延長而增加，這些性質與酶的基本特性相吻合。 綜上所述，我們成功構建了原核表達載體p