載體介導的RNA干擾技術對非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制作用.pdf

1、目的：構建小干擾RNA(siRNA)表達質粒，觀察質粒介導的RNA干擾技術能否有效的抑制A549細胞的增殖。 方法：針對表皮生長因子受體(EGFR)基因設計構建4個可表達特異性siRNA的重組質粒，利用核酸轉染試劑Lipofectamine<'TM>2000脂質體轉染到非小細胞肺癌細胞系A549細胞中。瞬時轉染分7組(pSilencer-1組、pSilencer-2組、pSilencer-3組、pSilencer-4組、p53-

2、pcDNA、脂質體組及空白對照組)，采用四甲基偶氮唑鹽比色試驗(MTT法)測定吸光度(A值)以觀察轉染后1、3、5、7日該細胞增殖的活力，并計算各組增殖抑制率。穩(wěn)定轉染則利用潮霉素對轉染后的細胞進行加壓篩選，得到可以穩(wěn)定表達該重組質粒的A549細胞，通過流式細胞儀測定細胞周期分布情況，比較各組G0/G1期細胞百分比。 結果：1.成功構建：EGFR基因的siRNA表達質粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳以及基因測序證實序列的正確。2.pSi

3、lencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3、pSilencer-4瞬時轉染A549細胞后均能引起細胞增殖活力的下降，與未轉染的空白對照組相比，結果有顯著差異(p<0.05)，與單轉染脂質體組相比較，也有顯著性差異(p<0.05)，與陽性對照P53-pcDNA組差異無顯著性(p>0.05)；P53-pcDNA組與脂質體組及空白對照組亦有顯著性差異(p<0.05)。而單轉染脂質體組與空白對照組相比較，差異無顯著性(p>

4、0.05)，且4個實驗組之間并無顯著性差異(p>0.05)。pSilencer-1組、pSilencer-2組、pSilencer-3組、pSilencer-4組在轉染后1、3、5、7天對細胞的增殖活力影響隨時間變化差異無顯著性(p>0.05)。3.pSilencer-1組、pSilencer-2組、pSilencer-3組、pSilence-4組及P53-pcDNA組在轉染后對A549細胞增殖的抑制率較脂質體組顯著增加(p<0.05)

5、，但4個實驗組之間及與P53-pcDNA組之間差異無顯著性(p>O.05)，且隨轉染時間變化不明顯(p>0.05)。4．穩(wěn)定轉染pSilencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3、pSilencer-4后G0／G1期細胞較空白對照組分別增加了29.03％、28.08％、18.65％、19.79％(p<0.05)，且pSilencer-1、pSilencer-2效果優(yōu)于pSilencer-3、pSilencer-4組(

6、p<0.05)。 結論：1．靶向EGFR的反向重復序列可插入pSilencer<'TM> 2.1-U6 hygro質粒中，成功的構建出在體內可表達出siRNA的重組質粒。2．靶向EGFR的siRNA表達質?？赊D染A549細胞。3．siRNA表達質粒瞬時轉染A549細胞，可有效地抑制細胞的增殖活力，在轉染后1、3、5、7天抑制率最高可達88.15％。4．穩(wěn)定轉染siRNA表達質粒的A549細胞其細胞周期分布發(fā)生了明顯變化，有更多的