高氧致BPD新生鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞SP-C表達的動態(tài)變化及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、隨著呼吸機輔助通氣的開展及早產(chǎn)兒管理技術的日益提高和肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)的廣泛應用，早產(chǎn)兒，尤其是極低出生體重兒的存活率有了明顯提高，隨之而來因長時間吸入高濃度氧所導致的早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)卻成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的重要疾病。因其發(fā)病機制尚不十分清楚，目前仍無有效的防治手段，這導致大概10～15％的患兒因嚴重的肺纖維化于生后1

2、年內(nèi)死于呼吸衰竭，存活者也因肺功能障礙需長期的依賴吸入氧氣或口服激素甚至是機械通氣。
　　氧療是臨床上非常重要的治療手段，但高氧所導致的肺損傷其不能回避的嚴重副作用之一。高氧可以導致炎癥，肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡，反應性增生，活性蛋白表達的改變，肺泡間隔增寬，間質(zhì)纖維化從而導致早產(chǎn)兒出現(xiàn)支氣管肺發(fā)育不良。肺泡Ⅱ型上皮細胞為高氧導致肺損傷的主要靶點，研究高氧引起的肺泡上皮細胞內(nèi)分子機制可以更好的應用輔助氧治療。
　　肺表面活性物質(zhì)

3、的缺乏和不成熟是發(fā)展成為支氣管肺發(fā)育不良的重要因素。由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌的肺泡表面活性物質(zhì)蛋白(SP)可以降低肺泡表面張力，防止肺萎縮和保持功能殘氣量。SP共分四個亞型，SP-A，SP-B，SP-C，SP-D。SP-A，SP-D主要功能為參與宿主防御，SP-B，SP-C的主要功能為降低肺泡表面張力。有實驗表明，成年鼠吸入高濃度的氧可以促使肺泡表面活性物質(zhì)分泌增加從而保護肺臟免于高氧的毒性損傷。疏水的SP-C被證實與板層小體的形成和分泌

4、有關，而板層小體在形成肺表面活性物質(zhì)單側(cè)及降低肺泡表面張力起到重要的作用最近的研究表明，大鼠剛出生時肺泡表面活性物質(zhì)蛋白的濃度較高，吸入正常濃度氧，肺泡表面活性蛋白的濃度逐漸下降，吸入高濃度氧的則SP-A，SP-B，SP-D的表達上升，但SP-C卻無表達上升，在高氧條件下SP-C的表達和分布的機制尚不明確。
　　本研究嘗試闡明高濃度氧導致SP-C在新生大鼠的肺組織中，大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞中，M LE-12細胞中堆積，自噬參與其發(fā)生

5、過程。高氧誘導通過激活非經(jīng)典自噬通路JNK信號分子上調(diào)自噬相關基因Atg7的表達，從而介導了SP-C在肺泡Ⅱ型上皮細胞中的堆積。
　　實驗材料和方法:
　　一、動物模型制備
　　將新生的Wistar大鼠（連同母鼠）于生后12小時內(nèi)置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2=0.85，CO2濃度＜0.5，溫度25～27℃，濕度50～70％。每天定時開箱0.5小時，添加水、飼料及更換墊料，并與對照組交換母鼠以避免因氧氣中毒致喂

6、養(yǎng)能力下降。對照組FiO2=0.21（即空氣），具體方法及實驗控制因素同實驗組。
　　二、細胞模型制備
　　小鼠肺泡Ⅱ上皮細胞MLE-12細胞（美國，ATCC）。應用HITES培養(yǎng)液（參考ATCC的標準培養(yǎng)方法），在37℃、5％CO2條件下將細胞按100，000細胞/孔接種在六孔板中培養(yǎng)。待細胞生長融合后，暴露至高氧環(huán)境(80％O2+5％CO2)進行后續(xù)實驗。
　　三、實驗標本采集及處理
　　每組分別于實驗后1、

7、3、5、7、14d隨機選取8只大鼠，處死后無菌取肺組織，用于肺形態(tài)學觀察免疫組織化學檢測的標本置于4％多聚甲醛中固定;用于超微結(jié)構(gòu)觀察的標本置于2.5％戊二醛中固定;Western Blot檢測的標本置于Eppendorf管內(nèi)，于-80℃冰箱中凍存。
　　肺泡盥洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的采集;大鼠于魯米那麻醉后，正中切開頸部皮膚，暴露氣管，插人套管針并固定，繼之向肺內(nèi)緩慢注入生理鹽

8、水0.5ml，然后回抽，反復操作3次，收集BALF，按3000g/min的速度離心10分鐘，小心吸取上清液保存Eppendorf管內(nèi)-80℃凍存待測。
　　四、實驗方法及檢測指標
　　（一）體內(nèi)試驗研究
　　1.免疫組織化學方法檢測SP-C在新生大鼠肺組織切片中的表達
　　2.Western blot方法檢測SP-C在新生大鼠肺組織中的表達
　　3.透射電鏡觀察AECⅡ超微結(jié)構(gòu)
　　4.ELISA方法

9、檢測BALF中SP-C的蛋白含量
　　（二）體外實驗研究
　　1.Western blot方法檢測SP-C在MLE-12細胞中的表達
　　2.應用免疫熒光的方法檢測SP-C在MLE-12細胞中的分布
　　3.透射電鏡觀察MLE-12細胞的超微結(jié)構(gòu)
　　4.ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中SP-C的蛋白含量
　　5.利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）預處理MLE-

10、12細胞后，檢測SP-C的表達情況
　　5.1 Western blot方法檢測SP-C在MLE-12中的表達
　　5.2.應用免疫熒光的方法檢測SP-C在MLE-12細胞中的分布
　　5.3透射電鏡觀察MLE-12細胞的超微結(jié)構(gòu)
　　5.4 ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中SP-C的蛋白含量
　　6.檢測Atg7調(diào)節(jié)SP-C在MLE-12細胞中的堆積
　　6.1 Western blot方法檢測A

11、tg7在MLE-12細胞中的表達情況
　　6.2 SiRNA處理Atg7后Western blot方法檢測Atg7在MLE-12細胞中的表達
　　6.3 SiRNA處理Atg7后Western blot方法檢測SP-C在MLE-12細胞中的表達
　　6.4 SiRNA處理Atg7后免疫熒光的方法檢測SP-C在MLE-12細胞中的表達
　　6.5 SiRNA處理Atg7后ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中SP-C的

12、蛋白含量
　　7.檢測高氧是否通過激活JNK通路上調(diào)Atg7的表達
　　7.1分別應用MAPK抑制劑U0126，SP600125，SB203580處理MLE-12細胞后Western blot方法檢測SP-C在細胞中的表達
　　7.2分別應用MAPK抑制劑U0126，SP600125，SB203580處理MLE-12細胞后ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中SP-C的蛋白含量
　　7.3分別應用JNK抑制劑SP60

13、0125或SiRNA JNK MLE-12細胞后Western blot方法檢測Atg7在MLE-12細胞中的表達情況
　　7.4分別應用JNK抑制劑SP600125和SiRNA JNK MLE-12細胞后免疫熒光方法檢測SP-C在MLE-12細胞中的表達
　　五、統(tǒng)計學分析
　　應用SSPS11.5統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用t檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬w內(nèi)試驗研究
　　

14、1免疫組化學結(jié)果表明，隨高氧暴露時間延長，SP-C在新生大鼠肺組織內(nèi)表達逐漸增加;
　　2.Western blot結(jié)果表明，隨高氧暴露時間延長，SP-C在新生大鼠肺組織內(nèi)表達逐漸增加
　　3.隨高氧暴露時間延長，肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)可見板層小體逐漸增多，并且觀察到在自噬小體內(nèi)出現(xiàn)板層小體樣結(jié)構(gòu);
　　4.ELISA結(jié)果表明BALF中SP-C的蛋白含量隨高氧暴露時間延長而逐漸減少;上述實驗結(jié)果表明，在高氧刺激下，新生大鼠

15、肺組織中肺泡Ⅱ細胞內(nèi)SP-C表達水平逐漸增多，并且堆積在細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)自噬體吞噬。
　?。ǘw外實驗研究
　　1.Western blot結(jié)果表明，隨高氧刺激時間延長，SP-C在MLE-12細胞內(nèi)表達水平逐漸增加;
　　2.免疫熒光實驗結(jié)果表明，隨高氧刺激時間延長，SP-C在MLE-12細胞內(nèi)熒光信號的強度逐漸增加;
　　3.透射電鏡的結(jié)果表明，在高氧刺激的作用下，在MLE-12細胞內(nèi)可見板層小體數(shù)目逐漸增多

16、，且呈現(xiàn)空泡狀改變，并且被自噬小體所吞噬;
　　4.ELISA結(jié)果表明，在高氧作用下的MLE-12細胞培養(yǎng)液上清中SP-C蛋白含量隨時間延長而逐漸減少;
　　5.利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)預處理MMLE-12細胞，抑制細胞自噬功能，進一步分析SP-C的表達變化情況:
　　5.1 Western blot結(jié)果表明，加入自噬抑制劑3-MA后SP-C在MLE-12細胞中的表達逐漸降低;
　　5.2免疫熒光

17、實驗表明，自噬抑制劑3-MA可以明顯抑制SP-C在MLE-12細胞中的表達;
　　5.3自噬抑制劑3-MA處理后，透射電鏡觀察到MLE-12細胞內(nèi)板層小體數(shù)量減少
　　5.4 ELISA結(jié)果表明，自噬抑制劑3-MA可以明顯增加MLE-12細胞培養(yǎng)液上清中SP-C蛋白的含量;
　　6.分析SP-C在MLE-12細胞中堆積的分子機制
　　6.1 Western blot結(jié)果表明，隨高氧時間延長，自噬相關基因Atg7在

18、MLE-12細胞內(nèi)表達水平的逐漸增加;
　　6.2.應用RNA干擾技術成功下調(diào)MLE-12細胞中Atg7的表達;
　　6.3可以明顯抑制高氧刺激所致的MLE-12細胞內(nèi)的SP-C表達水平的增加;
　　6.4免疫熒光結(jié)果表明，下調(diào)MLE-12細胞中Atg7的表達明顯減弱高氧刺激所致的MLE-12細胞內(nèi)SP-C的堆積;
　　6.5 ELISA結(jié)果表明，下調(diào)MLE-12細胞中Atg7的表達可以明顯抑制高氧刺激所致的ML

19、E-12細胞培養(yǎng)液上清中SP-C含量的減少;
　　7.進一步分析高氧誘導MLE-12細胞中Atg7表達上調(diào)的分子機制:
　　7.1用不同MAPK信號分子抑制劑U0126，SP600125，SB203580預處理MLE-12細胞后，發(fā)現(xiàn)特異性JNK信號分子抑制劑SP600125可以明顯抑制高氧所致的MLE-12細胞內(nèi)SP-C表達水平增加，細胞培養(yǎng)上清液中SP-C的減少以及MLE-12細胞內(nèi)SP-C免疫熒光信號的增加，同時可以明

20、顯抑制細胞內(nèi)自噬相關基因Atg7表達水平的增加;
　　7.3應用JNK抑制劑SP600125預處理細胞后或利用JNK SiRNA抑制細胞內(nèi)JNK信號分子的活化后，可以明顯抑制細胞內(nèi)自噬相關基因Atg7表達水平的增加及SP-C表達水平的增加。
　　結(jié)論:
　　1、高氧條件下，SP-C在新生鼠的肺組織肺泡Ⅱ細胞及體外培養(yǎng)的MLE-12細胞中表達水平增加，但肺泡盥洗液中和細胞培養(yǎng)上清液中含量的減少說明SP-C在肺泡Ⅱ細胞中堆