DHA對2型糖尿病大鼠心肌氧化應激的影響.pdf

1、目的:糖尿病已成為威脅人類健康與生命的重要殺手之一。糖尿病患者中將近95％是2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)患者，T2DM會引起全身并發(fā)癥，其中心臟并發(fā)癥是糖尿病患者高病死率的主要原因。而糖尿病心臟并發(fā)癥重要機制之一是氧化應激。
　　 氧化應激發(fā)生是由于組織細胞中活性物質——主要包括活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)和活性氮簇(reactivenitrogenspec

2、ies，RNS)產生過多，超過了抗氧物質的清除能力，致使生物大分子(包括脂質、糖、蛋白質與DNA)氧化。糖尿病時，高血糖長期持續(xù)刺激，使組織中活性物質生成增多，抗氧化系統(tǒng)功能下降，氧化與抗氧化失衡而產生氧化應激。
　　 二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)是n-3系多不飽和脂肪酸(n-3Polyunsaturatedfattyacids，n-3PUFAs)，具有抗氧化性，并且具有預防糖尿病心臟并發(fā)癥的

3、作用。那么，DHA是否對T2DM大鼠心肌中的氧化應激有改善作用？未見報道。
　　 基于上述目的，本實驗以2型糖尿病大鼠為研究對象，在有無DHA喂養(yǎng)的情況下，觀察大鼠心肌組織中的氧化應激以及組織中抗氧酶的活性，為DHA用于2型糖尿病心臟并發(fā)癥的防治提供實驗依據。
　　 方法:
　　 1.動物分組及取材
　　 以本研究組侯連國等人制備的2型糖尿病大鼠的心肌為材料。實驗動物分為對照組，糖尿病組和糖尿病+DHA組

4、（以下簡稱DHA組），取各組心肌用于活性氧簇(ROS)含量、總抗氧能力(totalantioxidantcapacity，T-AOC)、糖化終末產物(advancedglycationendproducts，AGEs)含量、蛋白質羰基化產物(proteincarbonylgroups，PCG)含量、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)含量、4-羥基己烯醛(4

5、-hydroxy-2-hexenal，4-HHE)含量及抗氧酶活性的測定。
　　 2.T2DM大鼠心肌氧化應激水平的測定
　　 2.1.總抗氧化能力(T-AOC)測定
　　 組織中抗氧化物質能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩(wěn)固的絡合物，通過比色法可測出其抗氧化能力的高低。結果以每毫克樣本蛋白含有的抗氧化物質單位表示(U/mgprot)。
　　 2.2.活性氧簇(ROS)含量測定
　

6、　 取不同組的實驗組心肌切片進行ROS熒光探針—二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)染色，根據熒光顯微鏡下紅色熒光的產生，測定平均光密度值(integratedopticaldensity,IOD)，來判斷各組ROS含量的多少和變化。
　　 2.3.糖化終末產物(AGEs)含量測定
　　 酶聯免疫吸附劑測定法進行測定，結果以每微克樣本蛋白含有的糖化終末產物的納摩爾數表示(nmol/μgprot)。

7、　　 2.4.蛋白質羰基化產物(PCG)含量測定
　　 采用以2，4-二硝基苯肼比色法進行測定，結果以每毫克樣本蛋白含有的蛋白質羰基化產物的納摩爾數表示(nmol/mgprot)。
　　 2.5.丙二醛(MDA)含量的測定
　　 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法進行測定，結果以每毫克樣本蛋白含有的丙二醛的納摩爾數表示(nmol/mgprot)。
　　 3.T2DM大鼠心肌抗氧酶活性的測定
　　

8、3.1.總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的測定
　　 使用黃嘌呤氧化酶法，測定組織中SOD對超氧陰離子自由基的抑制率，計算被測樣品SOD活力。結果以每毫克樣本蛋白含有的酶活性單位表示(U/mgprot)。
　　 3.2.銅鋅-超氧化物岐化酶(CuZn-SOD)活性的測定
　　 使用黃嘌呤氧化酶法，測定組織中SOD對超氧陰離子自由基的抑制率，計算被測樣品SOD活力。再用特異性抑制劑抑制Mn-SOD活性，可得到Cu

9、Zn-SOD的活性，結果以每毫克樣本蛋白含有的酶活性單位表示(U/mgprot)。
　　 3.3.谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定
　　 GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用，生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈現較穩(wěn)定的黃色，用比色法測定吸光度值，計算單位時間內消耗的GSH的量，再計算GSH-Px的活性，結果以每毫克樣本蛋白中含有的酶活性單位表示(U/mgprot)。
　　 3.4.過氧化氫酶(CAT)活性的

10、測定
　　 CAT分解H2O2的反應可以通過加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產生淡黃色絡合物，比色法測定其生成量，計算CAT活力。結果以每毫克樣本蛋白含有的酶活性單位表示(U/mgprot)。
　　 4.T2DM大鼠心肌組織中n-3與n-6系脂肪酸代謝產物變化
　　 4.1.4-羥基壬烯醛(4-HNE)含量的測定
　　 利用免疫組化方法，分別對正常對照組、糖尿病組和DHA組的組織切片進行4

11、-HNE抗體染色，熒光顯微鏡掃描圖片，對抗體分布光密度值進行測定，結果用各組IOD值平均數表示。
　　 4.2.4-羥基己烯醛(4-HHE)含量的測定
　　 利用免疫組化方法，分別對正常對照組、糖尿病組和DHA組的組織切片進行4-HH抗體染色，熒光顯微鏡掃描圖片，對抗體分布光密度值進行測定，結果用各組IOD值平均數表示。
　　 結果:
　　 1.DHA改善了T2DM大鼠心肌氧化應激水平
　　 1.

12、1.總抗氧能力(T-AOC)(U/mgprot)
　　 對照組1.48±0.11，糖尿病組1.16±0.15，DHA組1.54±0.39。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中總抗氧能力明顯降低(P＜0.05);DHA組與糖尿病相比，心肌中總抗氧能力明顯增強(P＜0.05)。而對照組與DHA飲食組沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。表明DHA增強了糖尿病大鼠心肌的總抗氧能力。
　　 1.2.活性氧簇(ROS)含量(IOD)<

13、br>　　 對照組3.97±0.23，糖尿病組13.38±1.42，DHA組5.23±0.74。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中活性氧簇的含量明顯升高(P＜0.05);DHA組與糖尿病相比，DHA組大鼠心肌組織中，活性氧簇的含量明顯降低(P＜0.05）。與對照組相比，DHA組心肌中ROS含量沒有差別(P＞0.05）。表明DHA降低T2DM大鼠心肌的ROS。
　　 1.3.糖化終末產物(AGEs)含量(nmol/μgpro

14、t)
　　 對照組0.11±0.009，糖尿病組0.14±0.008，DHA組0.12±0.007。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中糖化終末產物的含量明顯升高(P＜0.05);DHA組與糖尿病相比，DHA組大鼠心肌組織中，糖化終末產物的含量明顯降低(P＜0.05）。與對照組相比，DHA組心肌中AGEs含量無差別(P＞0.05）。表明DHA有效改善了糖尿病大鼠心肌組織中的糖過氧化水平。
　　 1.4.蛋白質羰基化產物

15、(PCG)含量(nmol/mgprot)
　　 對照組3.79±0.34，糖尿病組5.22±0.67，DHA組3.80±0.39。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中蛋白質羰基的含量明顯升高(P＜0.05);DHA組與糖尿病相比，DHA組大鼠心肌組織中，蛋白質羰基的含量明顯降低(P＜0.05）。而對照組與DHA飲食組沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。表明，DHA有效改善了糖尿病大鼠心肌組織中的蛋白質過氧化水平。
　　 1

16、.5.丙二醛(MDA)含量(nmol/mgprot)
　　 對照組1.18±0.05，糖尿病組1.26±0.09，DHA組1.54±0.18。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中MDA的含量增加(P＜0.05);DHA組與對照組相比，DHA組大鼠心肌組織中，MDA含量明顯增加（P＜0.05）。表明，給予糖尿病大鼠DHA后，心肌組織中脂質過氧化增強。
　　 2.DHA對T2DM大鼠心肌抗氧酶的活性影響不大
　　

17、2.1.總超氧化物岐化酶(T-SOD)活性(U/mgprot)
　　 對照組147.74±27.31，糖尿病組142.984±23.54，DHA組138.69±24.40。糖尿病組與對照組相比，大鼠心肌T-SOD活性降低，但結果沒有統(tǒng)計學差異。DHA組與糖尿病組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。表明，DHA對糖尿病大鼠心肌中的T-SOD活性沒有影響。
　　 2.2.銅鋅-超氧化物岐化酶(CuZn-SOD)活性(U/mgprot)

18、
　　 對照組92.81±10.09，糖尿病組94.81±19.63，DHA組96.61±15.70。各組之間沒有統(tǒng)計學差異。表明，DHA對糖尿病大鼠心肌中的CuZn-SOD活性沒有影響。
　　 2.3.谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性(U/mgprot)
　　 對照組171.73±19.83，糖尿病組139.23±11.60，DHA組134.39±22.13。糖尿病組與對照組相比，DHA組與糖尿病組相比，

19、心肌組織中GSH-Px活性的差異均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。表明，DHA對糖尿病大鼠心肌中的GSH-Px活性沒有影響。
　　 2.4.過氧化氫酶(CAT)活性(U/mgprot)
　　 對照組10.50±1.30，糖尿病組17.94±3.93，DHA組16.74±1.91。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中CAT的活性升高(P＜0.05);DHA組與糖尿病組相比，DHA組大鼠心肌中CAT的活性沒有太大的變化。表

20、明，DHA對糖尿病大鼠心肌中的CAT活性沒有影響。
　　 3.DHA分別降低和增加了T2DM大鼠心肌組織中n-3和n-6系脂肪酸氧化產物
　　 3.1.4-羥基壬烯醛(4-HNE)含量(IOD)
　　 對照組7.90±0.54，糖尿病組17.65±1.27，DHA組5.93±0.53。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中4-HNE的含量明顯增高(P＜0.05）;與正常組相比，DHA組大鼠心肌組織中，4-HNE含

21、量降低（P＜0.05）。糖尿病組較DHA組4-HNE含量升高明顯(P＜0.01）。表明，DHA降低糖尿病大鼠心肌中n-3PUFAs的氧化，減少了4-HNE的產生。
　　 3.2.4-羥基己烯醛(4-HHE)含量(IOD)
　　 對照組1.06±0.13，糖尿病組4.58±0.44，DHA組16.50±0.93。糖尿病組與對照組相比，糖尿病大鼠心肌中4-HHE的含量增加(P＜0.05);DHA組與對照組相比，DHA組大鼠心