Treg細胞和IL-18在腦膠質瘤中的作用研究.pdf

1、目的：腦膠質瘤，尤其是高級別膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，腫瘤呈浸潤性生長，手術很難將其全部切除，盡管結合放化療等綜合治療，但膠質瘤患者的預后仍十分不理想，復發(fā)率高，高級別膠質瘤患者的生存時間甚至不足1年。隨著分子生物學研究的不斷進展，膠質瘤的免疫治療逐步得到人們的重視。
　　 膠質瘤細胞的侵襲性與其復雜的病理生理學特點有關，其逃逸免疫監(jiān)視能力限制了機體產(chǎn)生有效抗腫瘤免疫反應，調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+T細胞，

2、Treg)在腫瘤細胞免疫逃逸過程中扮演重要角色。Treg細胞具有免疫抑制作用，對維持機體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。Treg細胞在抑制效應性T細胞功能的同時，也降低機體對腫瘤細胞的免疫反應，間接促進了腫瘤細胞的生長。在多種惡性腫瘤組織中（如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，惡性淋巴瘤等）有大量Treg細胞浸潤，其在患者外周血淋巴細胞中的比例也明顯升高。并且，Treg細胞的數(shù)量與腫瘤的發(fā)展和預后呈負相關，清除Treg細胞或抑制其功能有助于機體抗腫瘤

3、免疫功能的恢復。
　　 Treg細胞分為天然型和誘導型，前者由胸腺產(chǎn)生，后者可在外周由非調節(jié)性T細胞轉化而來。在腫瘤微環(huán)境中，異常增多的Treg細胞也分為兩類，一種是在腫瘤細胞趨化下，由外周遷徙而來，一種是在腫瘤局部特定環(huán)境中由非調節(jié)性T細胞轉化而來。浸潤在腫瘤中的Treg細胞在腫瘤細胞作用下分化成熟，具有腫瘤特異性，可阻止效應性T細胞（主要是CD8+和CD4+T細胞）的功能。在腫瘤局部，Treg細胞和效應性T細胞在數(shù)量上的不平

4、衡是引起腫瘤細胞免疫逃逸的重要因素。因此打破這種不平衡成為腫瘤免疫治療新的策略。
　　 白細胞介素18(IL-18)作為前炎因子，常高表達在多種自身免疫疾病組織及體液中，如類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、紅斑狼瘡等。在這些患者體內，Treg細胞明顯減少，而效應性CD8+T細胞功能由于失去Treg細胞的抑制作用而明顯上調，導致自身免疫性疾病發(fā)生。IL-18的高表達應與Treg細胞的減少存在某種關聯(lián)。此外，IL-18本身也具有明顯抗腫瘤功能

5、，包括誘導T細胞和NK細胞產(chǎn)生IFN-γ，增強NK細胞和CTL細胞的細胞毒性，促進活化的CD4+T細胞分化成為輔助性T細胞和效應性T細胞。在腫瘤動物模型研究及臨床試驗中，IL-18已被證實具有抗腫瘤功能，但在腫瘤微環(huán)境中是否能夠逆轉Treg細胞的免疫抑制作用，尚缺乏研究報道。本研究旨在探討Treg細胞在腦膠質瘤組織中的數(shù)量與腫瘤發(fā)展的關系，探討其免疫抑制性功能的機制，以及IL-18對Treg細胞的調節(jié)作用。
　　 方法：

6、　　 1.收集2007年9月至2009年9月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院神經(jīng)外科治療的腦膠質瘤患者的外周血及腫瘤組織標本，共76例。同期因腦疝行腦內減壓術獲得的正常腦組織標本及健康人群外周血標本作為陰性對照。
　　 分離腫瘤組織及正常腦組織中浸潤淋巴細胞及患者、健康對照者外周血單個核細胞。采用流式細胞術檢測組織中及外周血中Treg細胞、CD4+TCD8+T細胞的含量及比率，分析其與腦膠質瘤患者臨床、病理學特征及預后的關系。
　

7、　 采用ELISA法測定腦膠質瘤患者外周血中TGF-β1的含量。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術定量檢測外周血單個核細胞中Foxp3mRNA的含量，分析兩者表達的關系。
　　 2.收集2008年9月至2009年9月間在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院神經(jīng)外科治療的5例腦膠質瘤患者手術切除的新鮮腫瘤組織標本。采集同期健康志愿者外周血標本及行腦內減壓術獲得正常腦組織為對照。
　　 分別培養(yǎng)正常人腦星形膠質原代細胞及原代膠質瘤

8、細胞，采用免疫組織化學染色法進行鑒定。膠質瘤組織體外原代培養(yǎng)細胞及星形膠質細胞體外原代培養(yǎng)均獲成功，并經(jīng)免疫組化染色鑒定、證實。分離組織中浸潤淋巴細胞及外周血單個核細胞后，采用Mini MACS免疫磁珠分離技術獲得組織和外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25-及CD8+T細胞。經(jīng)免疫磁珠兩次分選后，CD4+CD25+T細胞的純度達89～92％，CD4+CD25-T細胞純度在90％以上，CD8+T細胞純度達87％～94％。按照不同比

9、例將CD4+CD25+T和CD4+CD25-T細胞或CD8+T細胞共同培養(yǎng)，采用[3H]-TdR摻入法檢測CD4+CD25+T對CD4+CD25-T細胞及CD8+T細胞增殖的影響。
　　 采用Western Blot法對不同來源的CD4+CD25+T細胞中Foxp3、CTLA-4、GITR、CCR4和CCR8蛋白進行定量檢測。采用ELISA法對膠質瘤組織原代培養(yǎng)細胞及不同來源CD4+CD25+T細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1、CCL

10、12和CCL22進行定量檢測。
　　 3.應用逆轉錄病毒載體LXSN，將插入IL-18基因的質粒感染PA317包裝細胞，經(jīng)G418篩選后獲得表達IL-18分子的PA317陽性細胞克隆，用IL-18/PA317培養(yǎng)上清轉染9L細胞，篩選出高表達IL-18的IL-18/9L細胞克隆，傳代培養(yǎng)。
　　 將雄性F344大鼠隨機分為2組，每組15只，分別顱內接種9L細胞和IL-18/9L細胞，每組分別在顱內接種腫瘤細胞后7天、14

11、天、21天時各處死3只大鼠，每組剩余的6只大鼠用于觀察生存期。
　　 采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術定量檢測各組大鼠腦膠質瘤組織中IL-18mRNA的表達。在顱內接種腫瘤細胞21天時，采用[3H]-TdR摻入法檢測各組大鼠脾細胞增殖反應情況，ELISA法檢測各組大鼠脾細胞IFN-γ的產(chǎn)生情況。采用流式細胞術檢測各組膠質瘤組織中Treg細胞、CD4+T、CD8+T細胞的含量及比率，分析其與大鼠膠質瘤生長及生存期的關系。

12、取接種9L細胞21天時的大鼠腫瘤組織，分離腫瘤組織中浸潤淋巴細胞，利用Mini MACS免疫磁珠分離系統(tǒng)，分選CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25-T細胞，將兩者共同培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入IL-18，觀察CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能的變化。
　　 結果：
　　 1.膠質瘤患者腫瘤組織和外周血單個核細胞中Treg細胞比例變化：流式細胞學檢測結果顯示，星形膠質瘤患者外周血單個核細胞中CD4+CD25+Foxp3+T

13、細胞的含量為10.41±2.13％，明顯高于健康人外周血（4.35±1.07％）(p＜0.01)。腦膠質瘤組織中Treg細胞比例為35.45±2.47％，明顯高于健康對照腦組織（Treg細胞含量2.53±0.75％）。膠質瘤組織中浸潤的Treg細胞含量與腫瘤的惡性程度呈正相關，而與患者年齡、性別、腫瘤大小、部位無關。不同病理學級別膠質瘤組織中CD8+T細胞比例無明顯差別（p＞0.05）。
　　 膠質瘤患者TIL或PBMC中Tre

14、g細胞比例變化：將膠質瘤患者TIL中Treg細胞所占比例的均值(M)作為閾值，分為高比值組(＞M)和低比值組＜M)，繪制兩組的生存曲線，應用log-rank法進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，Treg細胞比例與患者預后無明顯關聯(lián)，高比值組患者的生存期與低比值組無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。而CD8+T細胞在腫瘤組織的浸潤數(shù)量亦與患者預后無關(p＞0.05)。而以腫瘤組織中CD8+T/Treg細胞比值作為觀測指標時，其比值與膠質瘤患者預后呈正相關

15、，高比值組患者的生存期明顯長于低比值組，兩者具有顯著差異(p＜0.05)。
　　 膠質瘤患者外周血單個核細胞Foxp3mRNA表達及TGF-β1含量：膠質瘤患者外周血單個核細胞中均可見Foxp3mRNA表達，明顯高于健康人，并隨膠質瘤惡性級別的增加而升高(p＜0.05)。膠質瘤患者外周血中均可檢測到TGF-β1，并隨著腫瘤惡性程度的升高而增加。直線回歸分析顯示，外周血TGF-β1含量與PBMC中Foxp3mRNA的表達呈正相關(

16、r=0.940，p＜0.05)。
　　 2.不同來源Treg細胞F0xp3、CTLA-4、GITR蛋白表達：Western Blot分析結果顯示，不同來源的CD4+CD25+T細胞均檢測到Foxp3、CTLA-4及GITR蛋白表達，而CD4+CD25-T細胞無相應蛋白表達。源自膠質瘤患者外周血及腫瘤組織中的Treg細胞，F(xiàn)oxp3表達明顯高于健康人。而在不同來源CD4+CD25+T細胞之間，CTLA-4和GITR的表達并無明顯區(qū)

17、別(p＞0.05)。源自膠質母細胞瘤患者TIL中的CD4+CD25+T細胞高表達CCR4（0.64±0.21），顯著高于健康者外周血中CD4+CD25+T細胞的含量（0.27±0.13）(p＜0.05)（Fig2-8），但CCR8在膠質母細胞瘤患者中和健康者外周血中均未見明顯表達。
　　 CD4+CD25+T細胞對CD4+CD25-T及CD8+T細胞增殖的影響：在抗人CD3單克隆抗體作用下，將不同比例CD4+CD25+T細胞和C

18、D4+CD25-T細胞及CD8+T細胞共同培養(yǎng)，CD4+CD25+T細胞可明顯抑制CD4+CD25-T細胞及CD8+T細胞的增殖。隨著CD4+CD25+T細胞數(shù)量的增加，對CD4+CD25-T細胞及CD8+T細胞的抑制率逐步升高。
　　 原代膠質瘤細胞、不同來源CD4+CD25+T細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的水平：ELISA檢測結果顯示，體外培養(yǎng)的原代膠質瘤細胞及不同來源CD4+CD25+T細胞均分泌TGFβ1，而在正常人腦星形

19、膠質細胞培養(yǎng)上清中，未檢測到TGF-β1。在來源于膠質母細胞瘤患者TIL及PBMC的CD4+CD25+T細胞中，TGF-β1的分泌量分別為6.21±1.14μg/ml和5.47±1.05Ltg/ml，兩者無明顯差異（p＞0.05），但均明顯高于健康者外周血中的CD4+CD25+T細胞（2.32±0.61μg/ml）(p＜0.05)。原代膠質瘤細胞大量分泌CCL22（12.17±1.23μg/ml），明顯高于CCL12（4.68±0.83

20、μg/ml）(p＜0.05)。
　　 3.接種親代鼠腦膠質瘤細胞9L的F344大鼠腫瘤組織中，CD4+CD25+Foxp3+T細胞的浸潤數(shù)量明顯增多，并呈現(xiàn)出時間依賴性。
　　 接種IL-18/9L和9L細胞大鼠腦腫瘤組織中IL-18mRNA表達：分別取接種IL-18/9L細胞和9L細胞21d時的大鼠腦腫瘤組織，經(jīng)RT-PCR分析，結果表明：IL-18/9L細胞組大鼠腦腫瘤組織中有IL-18mRNA表達，而接種9L細胞組

21、大鼠腦腫瘤組織中無IL-18mRNA表達，說明IL-18/9L細胞在荷瘤大鼠體內仍可表達IL-18。
　　 IL-18對大鼠脾細胞IFN-γ產(chǎn)生的影響：接種IL-18/9L細胞組大鼠脾細胞可產(chǎn)生高水平IFN-γ（178.2±13.1pg/ml），明顯高于接種9L細胞組(40.7±5.3pg/ml)(p＜0.01)。
　　 IL-18對CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能的影響：在不同CD4+CD25+T:CD4+CD25

22、-T細胞比例下，IL-18均不能影響CD4+CD25+T細胞對CD4+CD25-T細胞的增殖抑制，與對照組比較無顯著差異(p＞0.05)。
　　 接種IL-18/9L組大鼠生存期為66.3±5.02d，明顯長于接種9L細胞組大鼠（43.5±3.87d）(p＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.膠質瘤患者外周血、腫瘤組織中Treg細胞含量明顯增加。膠質瘤組織中CD8+T/Treg細胞比值與患者的預后呈正相關。Tr

23、eg細胞在膠質瘤組織中的比例尚不能單獨作為患者預后的指標。膠質瘤患者外周血中Treg細胞的數(shù)量與血漿TGF-β1的水平呈正相關。
　　 2.Treg細胞在膠質瘤中聚集和發(fā)揮免疫抑制作用的可能機制是：膠質瘤細胞通過CCL22/CCR4趨化作用，驅使Treg細胞由外周向腫瘤部位遷移，并在腫瘤部位通過分泌TGF-β1誘導非Treg細胞向Treg細胞轉化和成熟、Treg細胞通過細胞-細胞接觸和分泌抑制性細胞因子TGF-β1發(fā)揮免疫抑制作