shRNA對胰腺癌K-ras突變基因交叉抑制作用的體內實驗研究.pdf

1、目的：研究短發(fā)卡RNA(short hair RNA，shRNA)在動物體內發(fā)揮的RNA干擾(RNA interference，RNAi)的作用，通過構建重組質粒載體在mRNA水平和蛋白表達水平探討特異性shRNA針對胰腺癌細胞Pane-1和MiaPaCa-2突變型K-ras基因表達的干擾作用以及對腫瘤生長的抑制作用，并且通過交叉對照組和實驗組及未治療組進行比較研究探討針對某一突變類型的特異性shRNA對其他突變類型是否存在影響。

2、 方法：根據(jù)兩種胰腺癌細胞Panc-1和MiaPaCa-2的K-ras基因第12位密碼子點突變的不同突變類型設計目的基因序列，并將目的基因插入pGenesil-1質粒載體中構建成含有特異目的基因的重組質粒表達載體，經測序證實，所構建的重組治理表達載體中的插入序列與我們設計的目的基因序列相同。建立胰腺癌細胞的裸鼠皮下移植瘤模型并分為五組：未治療組(control group)、交叉對照組(cross control group)、空質粒

3、組(blank plasmid control group)、治療組(experimentgroup)和隨機序列的陰性對照組(negative control group)。交叉治療組是把含有針對Pane-1細胞K-ras基因突變的重組質粒注射入MiaPaCa-2移植瘤內，把含有針對MiaPaCa-2細胞K-ras基因突變的重組質粒注射入Pane-1移植瘤內，了解其是否具有特異性；治療組是針對K-ras基因突變類型注射相應的特異重組質粒

4、。利用大腸桿菌DH5 α擴增重組質粒，用質粒提純試劑盒對質粒進行純化處理，然后把提純后的各種質粒分別注射入各組裸鼠的移植瘤內，每兩天注射一次并定期測量移植瘤的長徑和短徑，四周后處死裸鼠取瘤。應用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)和流式細胞術(flow cytometry)對移植瘤組織分別從RNA水平和蛋白表達水平檢測重組治理表達載體對胰腺癌細胞

5、突變型K-ras基因表達的干擾作用。根據(jù)移植瘤的長徑和短徑計算體積并繪制各組的腫瘤生長曲線，觀察重組治理表達載體對腫瘤生長情況的影響。 結果：反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)結果經SPSS統(tǒng)計分析處理顯示，胰腺癌細胞Pane-1的各組移植瘤中，只有轉導了針對其突變類型的特異重組質粒的治療組的mRNA表達明顯低于其他各組(P＜0.05

6、)，差別具有統(tǒng)計學意義；而交叉對照組與未治療組、空質粒組和隨機序列陰性對照組的mRNA表達無明顯差別(P＞0.05)，其差別無統(tǒng)計學意義。同樣，胰腺癌細胞MiaPaCa-2的各組移植瘤中，只有治療組的mRNA表達明顯低于其他各組(P＜0.05)，而未治療組、交叉對照組、空質粒組和隨機序列陰性對照組各組之間的mRNA表達無明顯差異(P＞0.05)。流式細胞術檢測結果經SPSS統(tǒng)計分析處理顯示，針對Panc-1移植瘤組織，治療組的蛋白表達明

7、顯低于其它各組(P＜0.05)，而未治療組、交叉對照組、空質粒組和隨機序列陰性對照組各組之間的蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)：針對MiaPaCa-2移植瘤組織的蛋白表達也符合上述結果。腫瘤生長曲線經SPSS13.0統(tǒng)計分析處理顯示，治療組腫瘤的體積明顯小于各對照組(P＜0.05)，生長速度也明顯低于各對照組(P＜0.05)，有統(tǒng)計學意義；而各對照組之間的腫瘤體積和生長速度無明顯差異(P＞0.05)，無統(tǒng)計學意義。 結論：特異