芳香開竅法抗睡眠剝奪作用的實驗研究及大鼠睡眠剝奪自動記錄儀的研制.pdf

1、目的：睡眠剝奪是指機體由于自身生理、病理因素或環(huán)境的影響而喪失了生理所需睡眠量的狀態(tài)。在現(xiàn)代社會，隨著生活節(jié)奏的加快和特殊部門工作的需要，睡眠剝奪日益成為有害健康的普遍現(xiàn)象。目前，臨床常用的睡眠剝奪對抗藥物多數(shù)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，長期或大量使用會有多種不良后果，而且使用多受到管制。為此，在對睡眠生理功能、睡眠剝奪的不良后果、現(xiàn)有促醒藥物之優(yōu)劣以及中醫(yī)藥相關理論進行分析和研究之后，我們研制了以石菖蒲和冰片為主要成分的新型中藥促醒劑—芳香開

2、竅滴鼻劑。同時，為解決大鼠睡眠剝奪實驗時需人工記錄落水次數(shù)的問題，發(fā)明設計了新型應用儀器—大鼠睡眠剝奪自動記錄儀。本論文的目的是：觀察芳香開竅滴鼻劑抗睡眠剝奪的作用效果，探討其作用機制；評價大鼠睡眠剝奪自動記錄儀的應用情況，以便使其推廣應用。 方法：將大鼠隨機分為正常組、模型組、藥物高劑量組、中劑量組、低劑量組，實驗前各組分籠飼養(yǎng)適應環(huán)境1周。自制大鼠滴鼻器，鼻腔給藥。高劑量組每4小時一次，每次0.3ml·kg-1。中劑量每次0

3、.2ml·kg-1。低劑量每次0.1ml·kg-1。除正常組外，每組動物各進行72hREMSD。 1睡眠剝奪大鼠模型的建立與復制：采用小平臺水環(huán)境法(flowerpotstechnique)復制該模型。具體操作為：制作40×40×50cm的鼠箱，中間有直徑4.5cm，高10.0cm的平臺，平臺周邊注滿水，高約8.0cm，睡眠剝奪自動記錄儀探頭由箱底穿入平臺柱中，距離平臺頂端2.0cm左右。實驗動物進行72小時連續(xù)快動眼相睡眠剝奪

4、(rapideyemovmentsleepdeprivation，REMSD)。實驗前動物按組分籠飼養(yǎng)，適應環(huán)境6天。 2芳香開竅滴鼻劑的制備：石菖蒲及其它藥材(除冰片外)加8倍量水，浸泡1小時，加沸石5粒，用水蒸氣蒸餾法連續(xù)提取6-8小時(直至揮發(fā)油不再增多為止)，收集揮發(fā)油，乙酸乙酯萃取，分液收集后揮發(fā)干燥，即得備用揮發(fā)油。冰片1g研成極細粉，加入液體石蠟研勻，加備用揮發(fā)油1ml，攪拌使之充分溶解后，加液體石蠟至100ml。

5、 3芳香開竅滴鼻劑對睡眠剝奪大鼠行為學影響的實驗：大鼠落水次數(shù)及每次落入水中的時間由睡眠剝奪自動記錄儀自動記錄；其學習記憶功能用Y迷宮檢測；運動功能通過走橫木方法評價。 4芳香開竅滴鼻劑對睡眠剝奪大鼠腦電圖影響的實驗：用10％水合氯醛4ml/kg腹腔注射大鼠麻醉后，暴露顱骨背側(cè)，在前囟后3.5mm，中線兩側(cè)各3.1mm處，相當于海馬位置，植入兩枚直徑0.6mm的螺絲釘作為記錄電極和參考電極，在鼻骨旁植入第三枚電極作為地極

6、，電極深入顱骨下2.5mm。大鼠恢復一周后，用腦電圖儀，電壓0.5uv，連續(xù)記錄清醒狀態(tài)下各組大鼠的EEG，選用其中有代表性的10秒鐘記錄的波形，對其中各頻帶進行測量和分析。 5芳香開竅滴鼻劑對睡眠剝奪大鼠血液中生化指標影響的實驗：在采用小平臺水環(huán)境法對實驗大鼠進行連續(xù)72hREMSD后，所有動物于同一時間段內(nèi)快速經(jīng)腹主動脈抽取血標本，分離血清，低溫冰箱(-20℃)保存待測。放射免疫法檢測大鼠血清皮質(zhì)醇(Corticostero

7、idCORT)和促腎上腺皮質(zhì)激素(AdrenocorticotrophichormoneACTH)。 6芳香開竅滴鼻劑對睡眠剝奪大鼠海馬NO含量及NOS活性影響的實驗：大鼠REMSD72h后立即予10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4mg/kg)，開胸腹主動脈取血后，快速斷頭取腦，分離海馬，分析天平稱重，按質(zhì)量加入生理鹽水稀釋至10％，并以玻璃勻漿器勻漿，5400轉(zhuǎn)/分低溫離心10分鐘后沉淀，取上清液，硝酸還原酶法檢測NO，酶法檢測

8、NOS。 7芳香開竅滴鼻劑對睡眠剝奪大鼠腦干單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量影響的實驗：大鼠REMSD72h后斷頭，于冰浴下迅速分離出腦干，稱重，置玻璃勻漿器中按一定比例(0.05ml/100mg)加入2％三氯醋酸溶液(預冷至4℃)，溫和勻漿，勻漿液用吸管小心轉(zhuǎn)移入離心管中，用一定比例(0.2ml/100mg)的NaH2P04溶液(0.33mol/L，PH6，內(nèi)含0.5mmol/LNa2EDTA)蕩洗勻漿器，洗液并入離心管，混旋均勻，低溫高速

9、離心(4℃，10000r/min，20min)，取上清液50μl直接進樣，用高效液相電化學法測定5-HT、DA和NE含量。 實驗中所有的計量資料均以(-x±s)表示，并使用SPSS10.0forwindows統(tǒng)計軟件進行分析。 結(jié)果：1芳香開竅滴鼻劑高、中、低劑量組均可使睡眠剝奪大鼠每日的落水次數(shù)減少，差異有顯著性意義(P＜0.01)，三劑量組之間每日的落水次數(shù)無顯著性差別；與模型組比較，中劑量組大鼠的學習成績提高(P＜

10、0.05)；高劑量組的運動功能得分顯著高于模型組(P＜0.01)。 2睡眠剝奪組與正常組大鼠比較，腦電頻率減慢，波幅減小，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；各給藥組與模型組比較無顯著性差別，但有頻率加快，波幅增大的趨勢。 3睡眠剝奪大鼠血液中CORT含量較正常組顯著升高；中、低劑量組ACTH與模型組比較含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 4睡眠剝奪大鼠腦海馬中NO含量與NOS活性較正常組顯著升高，高、

11、中劑量組使其降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；低劑量組與模型組比較無顯著性差別。 5睡眠剝奪大鼠腦干內(nèi)5-HT含量比正常鼠升高，經(jīng)復方開竅滴鼻劑給藥后，5-HT含量升高；高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異，高劑量組最為明顯，低劑量組則差異不明顯。大鼠REMSD72h后腦干內(nèi)DA含量較正常鼠升高，差異有統(tǒng)計學意義，經(jīng)復方開竅滴鼻劑給藥后，DA含量升高；高、中、低劑量組與模型組比較有顯著性差異，高劑量組最為明顯。睡眠剝奪大

12、鼠腦干內(nèi)NE含量較正常鼠降低，差異有統(tǒng)計學意義，經(jīng)復方開竅滴鼻劑給藥后，NE含量升高；高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異，高劑量組最為明顯，低劑量組則差異不明顯。 結(jié)論：1芳香開竅滴鼻劑可顯著改善大鼠的疲倦程度，使大鼠SD期間落水次數(shù)減少，立于小平臺上的持久力增強；中劑量的滴鼻劑可顯著提高大鼠的學習能力；高劑量滴鼻劑可明顯改善SD大鼠的運動協(xié)調(diào)性。 2芳香開竅滴鼻劑對SD大鼠每日的腦電圖頻率與波幅均無顯著性影響，但每日

13、用藥后有腦電頻率增快，波幅加大的明顯趨勢，提示該藥物可對SD大鼠產(chǎn)生興奮作用。正常組與模型組腦電差異明顯，其頻率與波幅均高于模型組，說明SD本身對于正常大鼠是一個抑制的過程。 3SD的應激過程使大鼠HPAA功能亢進，表現(xiàn)為血清中CORT含量升高，但ACTH變化不明顯。而芳香開竅滴鼻劑可降低其血清ACTH含量，從而抑制SD應激大鼠HPAA的興奮性。 4芳香開竅滴鼻劑具有降低睡眠剝奪大鼠海馬NO含量及NOS活性的作用，可減輕