實驗動物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測方法的建立與初步應用.pdf

1、目的：實驗動物是生命科學研究的基礎和條件，實驗動物的質量直接影響眾多領域科學實驗的準確性，也關系到實驗動物從業(yè)人員和動物實驗操作者的健康。因此，實驗動物的微生物質量控制已納入國家標準。肺支原體(Mycoplasma pulmonis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是實驗動物微生物檢測需要排除的病原體，也是實驗動物常見的易感病原體，在大小鼠、豚鼠、地

2、鼠和兔中感染率可達到百分之幾，甚至百分之幾十，相對其它病原體感染率較高。
　　目前對實驗動物攜帶的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體的鑒定主要以分離純化培養(yǎng)、生化試驗等方法進行，存在費時費力、需要有經驗的技術人員以客觀指標加主觀判斷鑒定的缺點，如金黃色葡萄球菌從分離細菌到發(fā)出檢測報告往往需要48h，綠膿桿菌需要長達72h，而肺支原體培養(yǎng)完成檢測則需21天。而PCR(Polymerase Chain Reaction)技術以其簡便、

3、快速、準確等優(yōu)點已在臨床醫(yī)學疾病診斷等領域得到廣泛應用，理論上同樣也可應用于實驗動物的病原微生物檢測，但普通 PCR方法單管每次只能檢測一種病原體，不能滿足單管檢測多種病原體的實際需要，更滿足不了大樣本、快速、準確的檢測。
　　多重PCR（multiplex PCR）可以在同一管反應體系中擴增出大小不同的核酸片段，具有快捷方便、高通量等優(yōu)點。多重PCR如果應用在實驗動物微生物檢測中，可以同時檢測多種病原體，適合大量實驗動物微生物檢

4、測與鑒定，具有高靈敏性、高效性、高特異性和低成本性等優(yōu)點。
　　本研究目的是針對三種實驗動物病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體，建立多重PCR檢測方法，并與傳統(tǒng)的微生物檢測方法比較，檢驗多重PCR檢測方法的可操作性和準確性。
　　方法：
　　1、將金黃色葡萄球菌標準株轉接到SP瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后轉接到血液瓊脂培養(yǎng)基上進行分離與純化培養(yǎng)，顯微鏡鏡下觀察，進行血漿凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗；將綠膿桿菌標準株轉接

5、到NAC液體培養(yǎng)基，后轉接到NAC固體培養(yǎng)基上進行分離與純化培養(yǎng)，顯微鏡鏡下觀察，生化鑒定，氧化酶試驗，42℃生長試驗；將肺支原體接到液體培養(yǎng)基中，一周后進行觀察。
　　2、通過文獻查找肺支原體、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌特異性引物，使用Blast分析各病原體引物特異性；進行PCR擴增，對擴增產物進行測序，通過生物信息學分析驗證擴增產物正確性；
　　3、優(yōu)化PCR反應體系，檢測PCR方法的特異性和敏感性。將模板DNA按照10倍

6、的比例進行梯度稀釋，分別以稀釋后的模板DNA進行擴增；用接種針挑取菌落加入到裝有普通營養(yǎng)肉湯的試管中，放入37℃恒溫搖床中進行擴菌，將搖好的菌液按著10倍比例進行梯度稀釋，轉接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，提取菌液核酸進行PCR擴增；PCR擴增其他非目的菌進行特異性實驗。
　　4、將肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的基因組 DNA在同一反應體系同時擴增，并且在反應體系中加入細菌通用引物做為內質控，調整和優(yōu)化反應體系成分和反應條件，建立三種

7、病原體多重PCR檢測方法。選擇具有實驗動物生產資質的單位供應的動物：大小鼠共45只，采集實驗動物回盲部內容物或糞便以及動物氣管分泌物，提取核酸進行三種病原體多重PCR的檢測，同時進行傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法，將兩種檢測結果比較，檢驗多重PCR檢測方法的可操作性和準確性。
　　結果：
　　1、金黃色葡萄球菌在SP固體培養(yǎng)基上形成黃色的菌落，轉接血瓊脂平皿形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落；菌體形態(tài)為革蘭陽性球菌，排列成葡萄狀；甘露醇發(fā)酵

8、試驗為陽性；血漿凝固酶試驗為陽性。綠膿桿菌在NAC瓊脂平皿上形成扁平菌落，邊緣不齊呈鋸齒狀，大部分菌落可產生綠色色素而致使培養(yǎng)基呈綠色；菌體特征為革蘭陰性桿菌，菌體長短不一；各生化鑒定管陰陽性結果正確；氧化酶試驗和42℃生長試驗為陽性。肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。
　　2、獲得三種病原體的特異性引物，并通過Blast比對驗證引物的特異性，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體擴增產物大小分別為153bp、375bp和266bp

9、，其測序結果分別與Genebank對應序列（Sequence ID分別為: gb|DQ507378.1、dbj|AB926025.1、gb|KP836312.1）相似度分別為97.00％、98.90%和99.59%。
　　3、PCR特異性實驗：金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體特異性實驗結果，除標準菌株擴增出陽性條帶外，其它菌種均擴增陰性；敏感性實驗：金黃色葡萄球菌PCR擴增最小檢出DNA核酸量為1pg、最小檢出菌落數(shù)為2CFU；

10、綠膿桿菌PCR擴增最小檢出DNA核酸量為10pg，最小檢出菌落數(shù)為14CFU；肺支原體PCR擴增最小檢出DNA核酸量為1pg。
　　4、建立了金黃色葡萄球菌、肺支原體、綠膿桿菌和細菌通用基因的多重PCR擴增體系，其產物經瓊脂糖電泳出四個條帶，片段大小從小到大分別為153bp、266bp、375bp和520bp。PCR檢測實驗動物24h培養(yǎng)物中的菌落，其結果與實驗動物微生物檢測結果一致；檢測實驗動物糞便，檢測結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法相