凡納濱對蝦造血激素、F1Fo-ATP合酶β亞基和WSSV-VP37的相互作用研究.pdf

1、白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是養(yǎng)殖對蝦的主要病毒性病原之一，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。病毒感染是從病毒黏附蛋白與宿主表面受體相互作用開始的，因此研究病毒與宿主相互作用具有重要意義。在前期對WSSV與宿主相互作用蛋白的鑒定研究中，發(fā)現(xiàn)F1-ATP合酶β亞基可能以受體身份參與了WSSV的感染。Lin等發(fā)現(xiàn)F1-ATP合酶β亞基與造血激素（astakine，AST）存在特異性的結(jié)合作用。A

2、ST作為一種在甲殼動(dòng)物中具有促進(jìn)造血組織細(xì)胞分化和增殖的細(xì)胞因子，在太平洋蝲蛄中也被發(fā)現(xiàn)添加該蛋白可以促進(jìn)WSSV在造血細(xì)胞中增殖。F1-ATP合酶β亞基（ATPsyn-β）和造血激素都與WSSV感染密切相關(guān)，為進(jìn)一步了解兩蛋白在功能上的相互關(guān)系，解析其與WSSV的粘附蛋白VP37之間作用機(jī)制。本文通過Far-Western、免疫熒光定位法、原子力技術(shù)等，分別從蛋白水平和細(xì)胞水平鑒定了AST、ATPsyn-β和VP37之間的相互作用關(guān)系

3、，為探討WSSV感染宿主的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究共分為4部分：利用酶聯(lián)免疫結(jié)合法、Far-Western技術(shù)及競爭結(jié)合法在蛋白水平上鑒定AST、ATPsyn-β和VP37之間的相互作用關(guān)系；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光組織化學(xué)染色及細(xì)胞熒光免疫染色的方法對LvAST和ATPsyn-β進(jìn)行組織分布和細(xì)胞定位分析；利用激光共聚焦顯微鏡，運(yùn)用免疫熒光組織化學(xué)染色和細(xì)胞熒光免疫染色的方法在細(xì)胞水平上進(jìn)行LvAST、ATPs

4、yn-β和VP37、ATPsyn-β共定位及競爭抑制關(guān)系分析；利用原子力技術(shù)在納米水平獲取正常對蝦血淋巴細(xì)胞及WSSV感染后細(xì)胞的形態(tài)變化并進(jìn)行原子力顯微鏡探針標(biāo)記及其對LvAST、VP37和ATPsyn-β的結(jié)合關(guān)系驗(yàn)證。
　　1.蛋白水平上LvAST、VP37、ATPsyn-β的結(jié)合活性分析：誘導(dǎo)表達(dá)并純化LvAST、VP37和F1Fo-ATP synthase重組蛋白，運(yùn)用ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)、Far-Western的方法及競

5、爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測三蛋白的相互作用關(guān)系。研究結(jié)果表明，ATPsyn-β是LvAST和VP37共有的結(jié)合蛋白，而重組LvAST和VP37蛋白并不具有直接的結(jié)合作用；LvAST與VP37相互競爭抑制對方與ATPsyn-β的結(jié)合，并且這種競爭抑制作用與LvAST、VP37的蛋白量正相關(guān)。
　　2.LvAST和ATPsyn-β的組織分布和細(xì)胞定位分析：經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測表明LvAST在血淋巴細(xì)胞、肝胰腺、肌肉、淋巴器官和鰓中均有表達(dá)，與

6、免疫熒光組織化學(xué)方法的檢測結(jié)果相符；經(jīng)熒光強(qiáng)度定量分析發(fā)現(xiàn)LvAST在肝胰腺和鰓中分布最多；經(jīng)免疫熒光技術(shù)在細(xì)胞水平進(jìn)一步檢測LvAST在血淋巴細(xì)胞的分布，結(jié)果表明該蛋白不僅在血淋巴細(xì)胞內(nèi)存在，并且在血淋巴細(xì)胞外膜上有分布；免疫熒光組織化學(xué)方法的檢測ATPsyn-β也具有組織分布的廣譜性，并在鰓和肝胰腺組織中中含量較高。
　　3.細(xì)胞水平上LvAST、VP37和ATPsyn-β的相互結(jié)合關(guān)系分析：利用激光共聚焦顯微鏡運(yùn)用細(xì)胞熒光免

7、疫和熒光免疫組織化學(xué)染色的方法分別在血淋巴細(xì)胞內(nèi)，血淋巴細(xì)胞膜上和肝胰腺組織切片上對LvAST、ATPsyn-β和ATPsyn-β、VP37進(jìn)行共定位和競爭作用分析。研究結(jié)果表明：三者在細(xì)胞水平和組織水平均具有空間分布的一致性，并且LvAST和VP37相互競爭與ATPsyn-β的結(jié)合，同時(shí)LvAST能夠競爭抑制WSSV對ATPsyn-β的結(jié)合。
　　4.原子力顯微鏡獲取對蝦血淋巴細(xì)胞在正常及WSSV感染后的形態(tài)變化：
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8、1）利用原子力顯微鏡以AAC模式和MAC模式分別對空氣中液體狀態(tài)中的正常凡納濱對蝦血淋巴細(xì)胞進(jìn)行表征掃描ATPsyn-β。并在AAC模式下對WSSV感染的血淋巴細(xì)胞進(jìn)行表征掃描，以獲取差異性特征信息。結(jié)果在MAC模式下掃描得到的血淋巴細(xì)胞可分為兩類，A類細(xì)胞較大，平均大小為24×8μm，平均高度為531nm，B類細(xì)胞平均大小為16×14μm，平均高度為564nm；AAC模式下也可以掃描到兩類大小不同的細(xì)胞，但細(xì)胞高度均有縮減，其中A類細(xì)

9、胞平均高度為454nm，B類細(xì)胞平均高度為284nm。究其原因，可能是細(xì)胞干燥失水所致。這一結(jié)果為凡納濱對蝦血淋巴細(xì)胞的分類提供了一定的數(shù)據(jù)。在AAC模式下掃描WSSV感染的血淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞高度明顯降低至283nm和208nm，并且細(xì)胞邊界和內(nèi)部結(jié)構(gòu)變模糊。
　?。?）原子力顯微鏡探針標(biāo)記及其對LvAST、VP37和ATPsyn-β的結(jié)合關(guān)系驗(yàn)證：對原子力顯微鏡進(jìn)行探針標(biāo)記，分別利用標(biāo)記LvAST或VP37的探針，近一步驗(yàn)證三