水稻抗白葉枯病相關基因的轉基因研究及新型轉基因標簽的開發(fā).pdf

1、水稻白葉枯病是由水稻白葉枯病菌引起的細菌性病害，嚴重影響水稻的產(chǎn)量。目前，培育抗病品種是抵抗白葉枯病菌侵染的最經(jīng)濟有效的措施。然而，白葉枯病菌容易產(chǎn)生致病性的分化，因此，培育抗病品種不是一勞永逸的，需要不斷的利用基因輪換和多基因聚合等技術，以獲得廣譜并且具有持久抗性的品種。
　　本實驗室前期通過體細胞不對稱雜交技術，獲得了高抗白葉枯病菌的品種Y73。通過優(yōu)化AAM懸浮培養(yǎng)基配方和調(diào)整農(nóng)桿菌侵染溫度，將Y73的轉基因效率提高至66.

2、5％，并利用農(nóng)桿菌侵染實驗，初步探索了Y73中農(nóng)桿菌侵染相關基因的表達模式。另外，在分析芯片數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，一個NBS-LRR類基因的表達量在接種白葉枯病菌PXO341后明顯上調(diào)。利用分子克隆技術，克隆得到該基因，通過序列比對，發(fā)現(xiàn)其序列與玉米Rp1的序列具有較高的相似性，因此命名為OsRP1L1(Oryza sativa Rp1-like1)基因，RAP-DB(Rice Annotation ProjectDatabase)數(shù)據(jù)顯示該基因

3、編碼RPP13類似蛋白。本研究針對OsRP1L1展開了一系列的工作，對該基因的功能進行了分析，并已取得以下結果:
　　1.利用農(nóng)桿菌介導的轉基因技術獲得OsRP1L1超表達的轉基因植株。通過PCR鑒定和卡方分析，確認了三個單插入位點的純合體超表達株系。連續(xù)的觀察和檢測顯示，該基因的超表達可在后代中穩(wěn)定遺傳。
　　2.構建了雙分子熒光互補技術(bimolecular fluorescence complementation，B

4、iFC)相關載體，并在煙草瞬時表達系統(tǒng)中對該基因的互作進行了初步的研究。結果顯示，該基因沒有明顯的自身互作現(xiàn)象。目前我們已經(jīng)構建了酵母雙雜交(yeast two-hybrid system，Y2H)載體，并開展了相關的篩選工作，以期篩選與其互作的蛋白。
　　3.激素和環(huán)境脅迫處理顯示，在JA、SA、高鹽和高溫處理石狩白毛(OryzasativaL.ssp.Japonica cv.Ishikari-shiroge，I-S)后，OsR

5、P1L1表達量下降，2，4-D處理后OsRP1L1的表達量上調(diào)，說明該基因響應多種激素和非生物脅迫處理。芯片數(shù)據(jù)結果分析顯示，與對照相比，OsRP1L1超表達材料中有26個基因的表達差異大于2倍，其中有25個基因的表達上調(diào)，1基因的表達下調(diào)。查閱相關資料后發(fā)現(xiàn)，有7個基因同時也受OsbZIP46的調(diào)控。這些結果表明該基因在水稻抗病抗逆境途徑中具有潛在的信號傳導功能。
　　4.通過抗譜分析，我們發(fā)現(xiàn)該基因的超表達材料對部分生理小種的

6、抗病性有所改變。
　　5.構建了OsRP1L1-sGFP融合表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的轉化技術獲得了相應的轉基因植株。采用振動切片技術及激光共聚焦顯微觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光主要集中于細胞核中，推測OsRP1L1編碼蛋白定位于細胞核中。
　　此外，為加速相關轉基因操作中鑒定的效率，開發(fā)了HPT-mCherry融合標簽，研究成果如下:
　　1.利用融合PCR技術和分子生物學實驗，成功構建了包含HPT-mCherry融合標簽的轉