豬流行性腹瀉病毒受體pAPN功能域的初步鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)可導致仔豬的嚴重腹瀉，尤其在東亞各國傳播非常廣泛，每年都造成嚴重的經(jīng)濟損失。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是Ⅰ群冠狀病毒的成員。目前對于PEDV感染機理方面的研究較少，2007年豬氨基肽酶(porcine aminopeptidase N，pAPN)被證實為PEDV的功能性細胞感染受體，繼而又有研究從數(shù)量上證實增加pAPN的密度增大可

2、以PEDV感染率。2010年新的研究通過嘗試多種不同方式將pAPN添加到Vero細胞后再感染PEDV，進一步可證明pAPN對PEDV的入侵和增殖的促進作用。至今，還未見其它有關PEDV感染機理以及pAPN在PEDV感染過程中作用的研究報道。
　　 為進一步確定pAPN與PEDV結合的區(qū)域，首先將除去信號肽的pAPN分為SPA，SPB和SPC三段，接著利用一對同尾酶XholI和Sal I將信號肽分別與SPA，SPB和SPC相連接后

3、再構建到桿狀病毒表達載體pFastBac TM1上，通過桿狀病毒-昆蟲細胞表達體系進行表達。分得到的三段蛋白經(jīng)SDS-PAGE與Western-blot鑒定大小分別為SPA約42 kD，SPB和SPC均約56 kD，與預期值相符。再利用得到的蛋白免疫小鼠制備相應的抗血清，各段抗血清均可與天然pAPN反應，證明了所制蛋白具有一定特異性。
　　 為了使pAPN分段蛋白在真核細胞上進行表達，將與信號肽相連的SPA，SPB和SPC片段構

4、建到哺乳動物真核細胞表達載體pcDNA3.1上，分別將三個片段轉(zhuǎn)染到PEDV非容許性細胞MDCK上，應用免疫熒光檢驗其在MDCK細胞上的表達情況，結果表明SPA，SPB和SPC片段與天然pAPN的多抗血清反應均出現(xiàn)了明亮的綠色熒光，證明了三個片段轉(zhuǎn)染到MDCK后均得到表達。分別將表達三個片段的MDCK細胞接種PEDV48 h后觀察到細胞的病變情況，結果在SPC段的MDCK上接種PEDV48h后出現(xiàn)了明顯的細胞脫落，變形等病變。同樣，應用

5、免疫熒光技術也可以在轉(zhuǎn)染SPC片段的MDCK細胞上檢測出明亮而清晰的綠色熒光，進一步說明了表達的SPC可以與PEDV相結合。將PEDV在表達SPC的MDCK上連續(xù)傳代五代后通過PCR的方法仍可以檢測到PEDV的存在，這也證明了在MDCK上表達SPC段蛋白可使PEDV在非容許的細胞上進行增殖。最后在表達SPC的MDCK上添加相應片段抗血清，病變可被抑制發(fā)生。以上結果均說明SPC段在PEDV入侵細胞及增殖過程中發(fā)揮著重要的作用，即受體功能域