大豆NAC轉錄因子和RBR泛素連接酶編碼基因的鑒定與功能分析.pdf

1、大豆(Glycinemax(L.)Merrill)是屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體(2n=40)植物，是人類植物性蛋白質(zhì)的主要來源之一，又是重要的飼料和工業(yè)原料。借助分子生物學和遺傳學方法研究大豆的功能基因?qū)⒂欣谔岣叽蠖巩a(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性?；虻霓D錄表達在植物生長、發(fā)育和適應環(huán)境等生命活動中起著極其重要的作用，植物體基因組中編碼了大量轉錄因子來調(diào)控基因的轉錄，例如，植物基因組中的AP2/ERF,WRKY,ARF和NAC（NAM，

2、ATAF1，CUC2）等轉錄因子家族。然而僅對基因的轉錄水平進行調(diào)控，仍然不能實現(xiàn)對相應生命過程的精確控制，還需要對包括基因的轉錄在內(nèi)的信號級聯(lián)反應途徑中的不同階段在時間和空間上進行準確地調(diào)控，例如蛋白翻譯、蛋白修飾等。其中蛋白泛素化修飾是真核生物中特有且重要的蛋白翻譯后修飾過程，廣泛地參與了對有機體生理活動的調(diào)控。
　　本文擬通過鑒定、克隆和分析大豆中的NAC轉錄因子和RBR(RING-IBR-RING)泛素連接酶基因以及其功能

3、，為大豆基因轉錄調(diào)控和蛋白泛素化修飾的研究提供基礎。通過系統(tǒng)進化、蛋白序列及結構分析的方法對包含三種豆科植物在內(nèi)的NAC和RBR家族蛋白進行分析，研究豆科植物（特別是大豆）中NAC轉錄因子家族和RBR家族的進化特點。并利用組織表達、啟動子分析、原生質(zhì)體瞬時表達、酵母單雜交、以及異源表達等方法對鑒定到的5個NAC轉錄因子和11個RBR基因做了初步的分析，為進一步研究兩個家族基因在細胞信號傳遞過程中的功能奠定基礎。
　　一、NAC轉錄

4、因子是植物中特有的一類轉錄因子，參與了植物的生長發(fā)育、對非生物脅迫的響應、細胞凋亡、組織衰老和營養(yǎng)物質(zhì)的轉運等多種生理活動。本中心（國家大豆改良中心）研究人員從栽培大豆94-16的子葉折疊突變體中克隆的一個在根和葉片中上調(diào)表達的NAC基因，序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的GmNAC28(EU661925)相同，但該基因的功能并不清楚。本文從大豆94-16中克隆到4個新的編碼NAC家族蛋白的基因，分別命名為GmNLP1（GlycinemaxNAM

5、-likeProtein1）-GmNLP4，并對包括GmNAC28在內(nèi)的這5個基因進行了組織表達分析、啟動子分析以及轉基因等研究。
　　1.通過對Phytozome等數(shù)據(jù)庫中NAC家族蛋白序列搜索與分析，發(fā)現(xiàn)編碼NAC家族蛋白的基因存在于除兩種藻類以外的其它植物中，獲得包括大豆在內(nèi)的三十種植物的2676條NAC家族蛋白序列。對不同物種基因組中編碼NAC家族蛋白的基因的分析表明，被子植物中由于基因重復造成NAC家族基因數(shù)量增加。對豆

6、科（大豆、蒺藜苜蓿和菜豆），十字花科（擬南芥和油菜）和禾本科（水稻、玉米和谷子）的1109條NAC家族蛋白的系統(tǒng)進化分析表明，NAC家族蛋白可以劃分為八個不同的亞家族(Ⅰ～Ⅷ)。其中編碼亞家族Ⅷ的基因在豆科植物缺失。對NAC家族蛋白的序列結構分析表明各亞家族NAC結構域之間存在明顯的差異，而在族內(nèi)則表現(xiàn)保守。GmNLP1-GmNLP4和GmNAC28與CUC2，NACl等蛋白被聚在家族Ⅰ，并具有保守的DNA結合和二聚體形成必須的氨基酸殘

7、基。擬南芥NAC轉錄因子家族Ⅰ的基因參與頂端生長組織形成、子葉分離、葉片形態(tài)形成、植株衰老、以及側根形成等生理過程，因此推測在大豆中家族Ⅰ的基因GmNLP1-GmNLP4及GmNAC28可能具有類似的功能。對五個基因編碼的蛋白序列的分析表明，GmNLP1和GmNLP2蛋白之間的相似性為92.0％，GmNLP3和GmNAC28蛋白之間的相似性為76.6％。而其它三個基因之間以及與GmNLP1或GmNLP2的蛋白序列之間的相似性均不超過60

8、％。
　　2.GmNLP1-GmNLP4和GmNAC28基因在大豆根、莖、葉、花以及種子中的組織表達分析表明:GmNLP1和GmNLP2基因在大豆的根、花和種子等組織中表達，但GmNLP2基因在根部的表達水平較GmNLP1基因高而在花中則較低;GmNLP3基因在根、莖、花和種子表達，其中在根中具較高的表達水平;GmNLP4基因特異性地在根和花中表達，且表達水平比較低;GmNAC28基因在所有研究的組織中均有表達，但在根和種子中的表

9、達水平比較高。對種子發(fā)育過程中5個基因的表達分析表明GmNLP1-GmNLP3和GmNAC28基因的表達持續(xù)了種子發(fā)育的整個過程，但未檢測到GmNLP4基因在種子中的表達。GmNLP1和GmNLP2基因的表達水平隨種子發(fā)育提高，但在不同的時期出現(xiàn)了峰值。GmNLP3基因在種子發(fā)育過程中持續(xù)較高的表達水平。
　　3.擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達結果證明5個NAC編碼的蛋白均定位于細胞核中;酵母轉錄激活活性試驗表明5個基因都具有轉錄激活活性

10、，證明5個基因是作為轉錄激活因子參與細胞核中基因轉錄的調(diào)控。同源基因或者具有相似結構的基因往往具有相似的功能。本研究通過異源表達方法對克隆的大豆NAC基因在形態(tài)發(fā)生（植物器官形態(tài)建立）等生理過程中功能進行研究。轉化擬南芥及其NAC家族基因功能缺失突變體的結果表明，未觀察到過量表達5個NAC基因的轉基因擬南芥植株在生長發(fā)育過程中出現(xiàn)葉片、花以及莢果等器官明顯的形態(tài)變化。過量表達GmNLP3和GmNAC28基因的轉基因植株未出現(xiàn)提前衰老的現(xiàn)

11、象。在突變體(cuc1-13，cuc2-3)中過量表達GmNLP4基因未能夠回復其野生型表型。原因可能為:(1)NAC家族基因的功能冗余，過量表達未必能夠引起明顯的形態(tài)變化;(2)轉化的大豆基因與擬南芥突變體基因的功能不同而不能實現(xiàn)功能互補等。因此進一步將大豆內(nèi)的這些基因沉默也許能夠有助于揭示其在大豆中的功能。
　　4.進一步分析GmNAC28基因的啟動子序列，并通過構建具不同長度缺失的啟動子植物表達載體(ProGmNAC28∶G

12、US)對該基因的表達調(diào)控機制進行研究。ProGmNAC28∶GUS研究結果表明GmNAC28基因的表達位于葉緣齒尖、柱頭、花瓣與花萼的離層組織、衰老的花絲和雄蕊、以及根冠和根部維管組織中。啟動子分析與GmNAC28組織表達分析結果一致，并進一步表明GmNAC28基因可能與大豆組織的衰老相關，在根中作用于根部維管組織。在GmNAC28基因的啟動子序列中鑒定到兩段功能序列，分別包含一段參與GmNAC28基因轉錄調(diào)控的順式作用元件，其中的一段

13、序列位于基因上游-1015-1378bp之間，該序列的存在降低GmNAC28基因的表達水平;另一段序列位于+1-253bp之間，該序列是GmNAC28基因表達必須的，缺失導致GmNAC28基因不能夠表達。
　　二、蛋白泛素化修飾是細胞生命過程中重要的生化過程，在細胞中執(zhí)行多種重要的功能，例如，蛋白質(zhì)降解、基因表達調(diào)控、細胞信號傳遞、細胞分化與凋亡。RBR是新發(fā)現(xiàn)的含RING結構的一類蛋白，其中很多RBR具有泛素連接酶功能。動物中的

14、研究表明該家族的成員參與了多種重要的生理活動，但對該家族在植物中具體的功能還很少報道。
　　1.在大豆基因組中鑒定到24個編碼RBR結構域蛋白的基因，其中八個基因編碼的蛋白序列存在大片段缺失。對包含大豆等共32種植物中的651條含RBR結構域的蛋白序列進行了系統(tǒng)進化分析，將這些RBR家族蛋白劃分為六個亞家族（ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅠ/Helicase，PlantⅡA/B，PlantⅡC和ARA54）。大豆中

15、RBR家族同樣可以劃分到上述六個亞家族中。通過分析RBR結構域之外的蛋白序列結構、基因結構進一步證明了上述進化分析結果，ARIADNEA與ARIADNEB、PlantⅡA/B與PlantⅡC亞家族之間在蛋白結構上都表現(xiàn)出了較大的差異。對不同物種中RBR家族的分析表明，六個亞家族中除PlantⅡC和Helicase亞家族僅在被子植物中發(fā)現(xiàn)外，其余亞家族也存在于藻類和苔蘚類等低等植物中，說明RBR家族出現(xiàn)于藻類與其它種類的植物分離之前。本文

16、從大豆品種NN1138-2中克隆了11個包含有完整RBR結構域的大豆基因，并對它們進行了蛋白結構、基因表達以及功能定位等分析。
　　2.克隆的11個RBR基因分別屬于ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅠ/Helicase，PlantⅡA/B，PlantⅡC等五個亞家族。對各個亞家族的蛋白序列分析表明，每個亞家族蛋白除具有保守的RBR結構域外，不同亞家族的蛋白序列中還含有獨特的蛋白結構域?；蛑貜褪勾蠖够蚪M中具有九個P

17、lantⅡC亞家族基因，但序列和表達分析表明只有兩個基因是能夠表達的功能基因。原生質(zhì)體瞬時表達結果顯示克隆的大豆ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅡA/B，PlantⅡC等亞家族基因定位于細胞核中，推測這些家族基因可能參與細胞核內(nèi)蛋白的泛素化修飾。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)在Heliease和PlantⅡA/B亞家族成員蛋白序列中含有能夠與DNA和RNA結合的結構域，說明Helicase和PlantⅡA/B亞家族蛋白在執(zhí)行細胞功能的過

18、程中需要核酸的參與。通過組織表達分析對ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅡA/B，PlantⅡC等亞家族的11個基因研究表明，這些亞家族的RBR基因在大豆根、莖、葉、花以及發(fā)育中的種子等多個組織中均有表達。其中PlantⅡC亞家族基因GmRTRP5表現(xiàn)出與其他10個基因不同的特點，在各種組織的表達水平很低。qRT-PCR表明GmRTRP3-GmRTRP5等基因參與了植物對激素ABA、GA3以及Na+脅迫的響應途徑。
　

19、　基因轉錄和蛋白泛素化修飾是調(diào)控植物細胞生理活動的兩種重要途徑。大量研究表明通過對轉錄因子的蛋白泛素化修飾來調(diào)控基因的轉錄是表達調(diào)控的一個重要途徑，且已有實驗證明NAC家族轉錄因子中一些成員受到了泛素化修飾的調(diào)控，如SINAT5促進NACl蛋白泛素化修飾來抑制生長素信號傳遞。進一步研究RBR家族基因的功能，以及RBR泛素連接酶是否與NAC轉錄因子之間存在調(diào)控關系，將有利于我們進一步了解蛋白泛素化修飾和NAC轉錄因子在調(diào)控細胞信號傳遞途徑