萌芽綠豆抗敏抗氧化活性物質(zhì)分析及其作用機(jī)制研究.pdf

1、本論文基于植物化學(xué)、分析化學(xué)、藥理學(xué)和分子生物學(xué)研究綠豆(Vigna radiatus Linn)萌芽過(guò)程中抗敏活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其抗敏作用機(jī)理，考察活性成分代謝途徑及外源性植物激素干預(yù)對(duì)活性成分代謝的影響。對(duì)綠豆SOD和CAT基因進(jìn)行克隆和序列分析，并初步探討綠豆SOD和CAT的酶活性與基因表達(dá)的相關(guān)性。
　　將綠豆萌芽0-168h，每12h取出一組作為樣品進(jìn)行研究。通過(guò)體外透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)止癢實(shí)驗(yàn)，確定了抗敏活性較佳的綠豆

2、萌芽時(shí)間為48h。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化提取工藝及其數(shù)據(jù)是：80％乙醇回流提取，料液比為1:10，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2h。采用不同溶劑對(duì)提取物進(jìn)行萃取，乙酸乙酯層抗敏功效較佳，將該萃取物作為綠豆萌芽抗敏活性有效提取物。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS)技術(shù)定性鑒定出有效提取物中12種酚酸和6種黃酮類成分；通過(guò)液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(HPLC-QQQ/MS)技術(shù)定量分析有效提取物，其主要成分及其含量為：異牡荊素45.

3、75mg/g、異槲皮苷193.52μg/g、山奈酚-3-O-蕓香糖苷925.95ng/g、對(duì)香豆酸205.89μg/g。利用代謝組學(xué)研究手段，采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定出綠豆萌芽過(guò)程中21種多酚類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)多酚種類和含量呈現(xiàn)出隨萌芽時(shí)間發(fā)生顯著變化的規(guī)律；采用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)分析不同時(shí)期萌芽中主要的差異性物質(zhì)為8種黃酮類成分(牡荊素、異牡荊素、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓

4、香糖苷、異槲皮苷、染料木素、大豆苷元、異鼠李素)和2種酚酸類成分(莽草酸、咖啡酸)。采用高效液相色譜(HPLC)方法，對(duì)8種黃酮類差異性物質(zhì)進(jìn)行了定量分析。從酚酸及黃酮類物質(zhì)的變化規(guī)律中，總結(jié)歸納出綠豆萌芽過(guò)程中主要抗敏活性物質(zhì)的代謝途徑。
　　采用被動(dòng)皮膚過(guò)敏(PCA)、肥大細(xì)胞穩(wěn)定性以及肥大細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有效地評(píng)價(jià)了萌芽綠豆抗敏有效提取物的抗敏活性，模型組與空白對(duì)照組比較均有極顯著性差異(p<0.01)。當(dāng)有效提取物

5、為高、中劑量時(shí)，對(duì)上述三種模型均有顯著功效；當(dāng)有效提取物為低劑量時(shí)，對(duì)肥大細(xì)胞穩(wěn)定性以及肥大細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)兩種模型有顯著功效。研究結(jié)果表明：抗敏活性有效提取物通過(guò)抑制組胺釋放緩解過(guò)敏反應(yīng)導(dǎo)致的瘙癢，通過(guò)抑制被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)及增加肥大細(xì)胞穩(wěn)定性，緩解過(guò)敏導(dǎo)致的紅腫、泛紅等現(xiàn)象。采用 PMA聯(lián)合鈣離子載體誘導(dǎo)方法建立體外KU812嗜堿性細(xì)胞促炎細(xì)胞因子高表達(dá)模型，結(jié)果顯示，經(jīng)PMA和A23187誘導(dǎo)后，KU812細(xì)胞釋放組胺、TNF-α、

6、IL-1β、IL-6、IL-8，使用異槲皮苷干預(yù)后，高、中、低劑量(50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL)的異槲皮苷均可顯著抑制組胺釋放和促炎細(xì)胞因子表達(dá)，且呈劑量依賴性。說(shuō)明異槲皮苷可以通過(guò)抑制組胺和一系列促炎因子的釋放減輕過(guò)敏反應(yīng)中出現(xiàn)的皮膚病理?yè)p傷。同時(shí)，利用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)研究了異槲皮苷抗敏作用機(jī)理，異槲皮苷可顯著降低絲裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)通路細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的表達(dá)

7、和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路NF-κB的活性。與此同時(shí)，采用同樣的實(shí)驗(yàn)和方法，考察了萌芽綠豆有效提取物的抗敏機(jī)制，結(jié)果與異槲皮苷一致。異槲皮苷和萌芽綠豆有效提取物抗敏作用均是通過(guò)顯著降低MAPKs通路ERK的表達(dá)和NF-κB通路NF-κB的活性實(shí)現(xiàn)的。
　　通過(guò)研究7種植物激素對(duì)綠豆萌芽過(guò)程中活性成分的影響，篩選出MeJA對(duì)綠豆萌芽的影響最大，其較佳的使用濃度為1mmol/L。MeJA外源性干預(yù)可以顯著提高24-72h萌芽總酚含

8、量，進(jìn)而提高萌芽抗氧化功效。萌芽168h對(duì)香豆酸和異牡荊素的含量相比于干預(yù)前分別下降了42.00%和85.85%；山奈酚-3-O-蕓香糖苷、大豆苷元、染料木素、異槲皮苷和咖啡酸的含量相比于干預(yù)前均有不同程度的提高。說(shuō)明MeJA外源性干預(yù)可以有效提高綠豆萌芽抗敏活性物質(zhì)代謝水平，從而提高萌芽綠豆抗敏相關(guān)活性。
　　采用分子生物學(xué)手段對(duì)綠豆的VirSOD和VirCAT進(jìn)行基因克隆和序列分析，將綠豆SOD和CAT成功克隆所得DNA序列提

9、交GenBank，獲得到注冊(cè)號(hào)為HQ259252、HQ259253和HQ260597、HQ260598。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知：綠豆的VirSOD和VirCAT分別與其他豆科SODs和CATs聚為一個(gè)亞群。采用qRT-PCR的方法測(cè)定不同時(shí)期萌芽綠豆中VirSOD和VirCAT的表達(dá)，二者均在萌芽144h達(dá)到最高表達(dá)，此趨勢(shì)與SOD和CAT酶活性變化規(guī)律吻合，說(shuō)明萌芽過(guò)程中SOD及CAT酶活性增高與VirSOD和VirCAT的表達(dá)有關(guān)。