副豬嗜血桿菌——豬霍亂沙門(mén)氏菌二聯(lián)基因工程疫苗研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道中寄生的一種常在菌，但在動(dòng)物體應(yīng)激、免疫力低下等情況下某些分離株可侵入機(jī)體并引發(fā)嚴(yán)重的全身性疾病，臨床特征主要表現(xiàn)為纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。近年來(lái)鑒于養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)模式的不斷調(diào)整以及新型呼吸道疾病的層出不窮，副豬嗜血桿菌病日趨流行，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害。
　　 近年來(lái)基因工程產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，使得疫苗的研發(fā)無(wú)論在方法上還是在觀念

2、上都發(fā)生了重大轉(zhuǎn)變。當(dāng)前應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建沙門(mén)氏菌減毒菌株和利用減毒沙門(mén)氏菌作為活載體表達(dá)外源抗原研制多聯(lián)疫苗等已成為研究熱點(diǎn)之一。本課題是基于豬霍亂沙門(mén)氏菌C500菌株△asd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)進(jìn)行副豬嗜血桿菌-豬霍亂沙門(mén)氏菌二聯(lián)基因工程疫苗研發(fā)。基本思路是利用仔豬副傷寒商品疫苗菌株豬霍亂沙門(mén)氏菌C500作為宿主菌株，插入已經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鑒定的副豬嗜血桿菌重要免疫原性基因hps06257、HbpB及PalA，從而獲得副豬嗜

3、血桿菌-豬霍亂沙門(mén)氏菌二聯(lián)基因工程疫苗菌株C501(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)，并對(duì)這些重組菌株進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定、安全性評(píng)價(jià)以及免疫效應(yīng)方面的研究，為臨床副豬嗜血桿菌病的防制提供新對(duì)策。
　　 首先擴(kuò)增目的基因并將其連接至原核載體質(zhì)粒pYA3493中，獲得中間質(zhì)粒pYA-06257、pYA-HbpB、pYA-PalA。再將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至豬霍亂沙門(mén)氏菌asd基因缺失菌株C501中，構(gòu)建互補(bǔ)菌株C50

4、1(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)。PCR擴(kuò)增鑒定和測(cè)序結(jié)果證實(shí)二聯(lián)基因工程疫苗菌株構(gòu)建成功。對(duì)上述重組菌株的生物學(xué)特性鑒定研究表明:1）重組菌株能夠正確表達(dá)目的蛋白且保持其原有免疫特性;2）外源質(zhì)?？稍谒拗骶曛蟹€(wěn)定遺傳，保證了疫苗菌株的遺傳穩(wěn)定性;3）外源基因的插入對(duì)于載體菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有特別影響;4）在碳代謝方面重組菌與親本菌生化特征一致，外源質(zhì)粒的克隆與表達(dá)不影響沙門(mén)氏菌自身的碳代謝。
　　 重組

5、菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果顯示，C501(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)與空質(zhì)粒對(duì)照菌株C501(pYA3493)在小鼠體內(nèi)LD50非常接近，證明外源基因片段的插入基本不影響載體菌的弱毒特性。在本體動(dòng)物仔豬體內(nèi)進(jìn)行重組疫苗菌株的安全性評(píng)估，結(jié)果表明口服或肌肉注射10倍免疫劑量（300億）的疫苗菌株后仔豬的采食、飲水及精神狀態(tài)均比較正常，機(jī)體只在接種后第二天發(fā)生輕微發(fā)熱之外并無(wú)其他明顯的臨床癥狀。
　　

6、 副豬嗜血桿菌-豬霍亂沙門(mén)氏菌二聯(lián)基因工程疫苗對(duì)小鼠的免疫效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果表明:針對(duì)副豬嗜血桿菌強(qiáng)毒株致死劑量攻毒，口服組的攻毒保護(hù)率明顯高于注射組，其中C501(HbpB)口服組、C501(PalA)口服組免疫小鼠分別具有83.3％、100％的保護(hù)率;針對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌強(qiáng)毒株的致死攻毒結(jié)果表明，口服組的攻毒保護(hù)率略低于注射組，其中C501(HbpB)注射組、C501(PalA)注射組均能為機(jī)體提供87.5％的保護(hù)力。從整體來(lái)看不論是