穩(wěn)定表達(dá)雞恒定鏈基因的P815細(xì)胞株的建立及鑒定.pdf

1、恒定鏈（invariant chain,Ii）是主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子的伴侶蛋白之一，具有輔助其遞呈外源性抗原的功能。近期研究表明Ii還可作為細(xì)胞因子MIF的受體介導(dǎo)炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生。人和哺乳動(dòng)物Ii研究較為深入，禽類起步較晚，為了對(duì)雞Ii的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行深入研究，我們擬建立穩(wěn)定表達(dá)Ii的P815細(xì)胞株。首先以實(shí)驗(yàn)室保存的PMD18-T/Ii重組

2、質(zhì)粒為模板，根據(jù)其中雞Ii基因的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)PCR獲得了雞Ii鏈全長(zhǎng)基因片段。然后將其插入到真核熒光表達(dá)載體pDsRed2-N1，pEGFP-C1構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pDsRed2-N1/Ii，pEGFP-C1/Ii，經(jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選，EcoR I、Sal I雙酶切，PCR初步鑒定正確后，由上海生工進(jìn)一步測(cè)序鑒定。通過(guò)XfectTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將鑒定正確的重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞，觀察GFP-Ii,RFP-Ii表達(dá)

3、情況，發(fā)現(xiàn)熒光主要分布于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)。之后我們對(duì)人、牛、雞、鵪鶉的恒定鏈進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析，包括序列比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)的繪制、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和細(xì)胞內(nèi)定位特性的預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)此4個(gè)物種的Ii鏈同源性達(dá)到61.69％，其中人與牛同為哺乳動(dòng)物同源性高達(dá)81.3％，雞與鵪鶉同為禽類，同源性高達(dá)85.6％。進(jìn)化樹(shù)也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，人與牛，雞與鵪鶉分別表現(xiàn)出更近的進(jìn)化關(guān)系。在對(duì)該4個(gè)物種Ii蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬后，發(fā)現(xiàn)它們具有高度的結(jié)構(gòu)相似性，因此我們

4、推測(cè)它們的功能也是極為類似的，而經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)我們發(fā)現(xiàn)它們的細(xì)胞內(nèi)定位特性也確實(shí)十分相似。最后我們將pEGFP-C1/Ii轉(zhuǎn)染到P815細(xì)胞，通過(guò)G418壓力篩選獲得了抗3mg/ml G418的P815細(xì)胞株，RT-PCR結(jié)果表明該細(xì)胞株具有穩(wěn)定表達(dá)Ii的能力。通過(guò)對(duì)P815-GFP-Ii的熒光顯微鏡觀察我們發(fā)現(xiàn)GFP-Ii主要定位于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，在前人研究的基礎(chǔ)上，聯(lián)系Ii細(xì)胞內(nèi)定位特性預(yù)測(cè)結(jié)果，我們推測(cè)Ii在細(xì)胞核定位時(shí)主要分布與核膜上。