煙草中過表達番茄特異糖基轉移酶基因提高耐冷性.pdf

1、植物生長發(fā)育過程中經常遭遇各種逆境脅迫，嚴重影響產量和品質。植物通過一些基因的表達直接參與抗逆過程，或通過改變其他一些抗逆物質的水平間接提高植物的抗逆性，像轉錄因子、糖基轉移酶基因等。糖基轉移酶通過糖基化各種代謝物的親水性、結構穩(wěn)定性、亞細胞定位、生物活性來間接發(fā)揮抗逆作用。因此，糖基轉移酶的功能越來越引起人們的注意。
　　 本研究從番茄葉片中克隆了特異糖基化油菜素內酯的一個糖基轉移酶基因（LeUGT73C5），并對該基因的表達

2、和低溫條件下轉基因煙草的功能進行了分析。
　　 （1）利用NCBI提供的數據設計全長引物，使用RT-PCR的方法從低溫處理的番茄葉片中克隆到LeUGT73C5基因的全長序列。該基因cDNA全長為1735bp，編碼494個氨基酸。進化樹分析表明，LeUGT73C5與葡萄、蓖麻、毛果楊、水稻、擬南芥等植物的同一個基因具有高度的同源性，均含有保守序列PSPG盒。
　　 （2）將p35S-LeUGT73C5-GFP融合蛋白在擬南

3、芥原生質體中瞬時表達。通過Confocal觀察到GFP激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeLeUGT73C5基因產物定位于葉綠體。
　　 （3）Northern雜交分析表明，LeUGT73C5基因在植物體各個器官均有表達，但在葉片中表達量較高。同時該基因的表達受低溫、甲基紫精等誘導，其表達水平隨脅迫處理時間的延長而升高。
　　 （4）將獲得的LeUGT73C5基因與含有35S啟動子的pBI121載體重組

4、，構建了正義表達載體，利用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，用PCR及Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉基因煙草植株進一步檢測，結果證明成功地獲得了轉正義基因的煙草植株。
　　 （5）構建了原核表達載體pET-LeUGT73C5，并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白，將誘導帶切下，溶于PBS獲得抗原，免疫小白鼠。Western雜交表明，轉正義基因植株中LeUGT73C5基因已在蛋白水平上過表達。
　　 （6）正常生長條件

5、下，野生型與轉正義基因煙草植株生長量無明顯差別。但是，在低溫脅迫條件下，轉正義基因煙草植株比野生型表現出更強的耐性，尤其是在恢復過程中。這表明過表達LeUGT73C5基因提高了煙草植株的抗逆能力。
　　 （7）在低溫弱光（4℃，100μmol m-2s-1）條件下，野生型和轉基因株系的凈光合速率（Pn）和PSII最大光化學效率（Fv/Fm）下降，但與野生型相比，轉正義基因株系的下降緩慢，這表明LeUGT73C5的過表達減輕了PS