線蟲fat-1基因在家兔胎兒成纖維細胞中的表達研究.pdf

1、fat-1基因編碼ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶,可以將多不飽和脂肪酸從ω-6形式轉化為ω-3形式。ω-3多不飽和脂肪酸作為細胞構成的重要成分,一直以來受到人們的廣泛關注。研究表明,哺乳動物體內一定的ω-3多不飽和脂肪酸含量,可以起到預防心血管疾病、神經退行性疾病甚至癌癥的作用。但ω-3多不飽和脂肪酸在大多數(shù)動物體內不能合成,只能從食物中攝取。研究人員利用轉基因的方法制備了能夠表達fat-ι基因的轉基因動物,如小鼠、豬等,為研究ω-3多不飽

2、和脂肪酸的功能提供了高效、準確的醫(yī)學、營養(yǎng)學動物模型。隨著人們對ω-3多不飽和脂肪酸認識的增加,對富含這一成分的食品需求也將大大增加,fat-1基因在生產特殊農產品方面也具有十分大的潛力,亟待我們開發(fā)利用。本研究根據(jù)家兔基因密碼子使用偏好性,對引自GenBank的秀麗隱桿線蟲fat-1cDNA序列進行密碼子優(yōu)化,通過全基因合成的方法獲得優(yōu)化后的fat-1基因(命名為opfat-1);從秀麗隱桿線蟲中RT-PCR擴增獲得fat-1 cDN

3、A。將擴增的fat-1cDNA和合成的opfat-1基因分別構建到綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C1中。采用脂質體Lipofectamine轉染法將fat-1cDNA和opfat-1基因轉入家兔胎兒成纖維細胞中。對比不同DNA和轉染試劑用量以及細胞暴露于DNA、轉染試劑中作用時間探討影響家兔胎兒成纖維細胞轉染效率的參數(shù),通過綠色熒光標記、PCR和RT-PCR檢測轉染細胞中融合蛋白和目的基因的表達。結果表明:經過優(yōu)化,最優(yōu)的家兔胎兒

4、成纖維細胞轉染條件為:Lipofectamine用量為2-3μl,DNA量為0.8～1.0μg, Lipofectamine與DNA、細胞共培養(yǎng)時間為8h。熒光標記表明,密碼子優(yōu)化的opfat-1與fat-1 cDNA相比,體外瞬時表達效率有極為顯著的提高;G418抗性篩選獲得轉基因單克隆細胞,PCR、RT-PCR初步驗證fat-1 cDNA和opfat-1基因均在家兔胎兒成纖維細胞中穩(wěn)定轉錄表達。作為階段性成果,本研究的結果為進一步證