Fat-1轉基因克隆渤海黑牛研究.pdf

1、Fat-1基因編碼的產物是多不飽和脂肪酸脫氫酶，能將n-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)轉化為n-3 PUFAs。本研究利用MAR（matrix attachment regions）序列作為啟動元件，構建了MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR單順反子表達盒，轉染渤海黑牛胎兒成纖維細胞，通過有限稀釋法挑取單克隆細胞進行培養(yǎng)，提取基因組DNA進行鑒定，獲得了轉基因陽性單克隆細胞系。然后，對轉基因陽性細胞DNA整合，RNA、蛋白表達

2、、脂肪酸含量等鑒定分析。用pMAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR載體（單酶切載體）和MAR-CAG-Fat-1-PolyA-MAR載體（雙酶切載體）分別制備轉基因小鼠。將表達良好的轉基因單克隆細胞通過體細胞核移植技術制備克隆胚胎。結果表明，(1)獲得了穩(wěn)定轉染雙酶切載體的單克隆陽性細胞系，該細胞系的n-3 PUFAs表達水平升高且n-6/n-3PUFAs的比值降低。脂肪酸合成基因FASN、ACC、SREBP-1表達與對照相比明

3、顯降低，脂肪酸代謝基因PPARA、PPARG降低。細胞中fatl蛋白表達。(2)獲得了雙酶切和單酶切載體的轉基因小鼠。其中轉基因雙酶切鼠F0代7只，F(xiàn)1代3只，F(xiàn)2代2只;轉基因單酶切鼠F0代7只，F(xiàn)1代28只。轉基因雙酶切鼠F0、F1和F2代鼠的肌肉和脂肪組織中n-3 PUFAs含量均升高，n-6/n-3PUFAs比值均降低;轉基因單酶切鼠肌肉和脂肪組織中n-3 PUFAs含量降低，n-6/n-3 PUFAs比值升高。(3)雙酶切鼠肌

4、肉組織中脂肪酸相關基因實時定量分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成基因FASN、ACC、SREBP-1表達與對照相比明顯降低，脂肪酸代謝基因PPARA、PPARG表達降低。(4)蛋白差異表達和動態(tài)定量分析，發(fā)現(xiàn)單酶切組試驗差異蛋白有99個，其中上調蛋白62個，下調蛋白37個;雙酶切組試驗差異蛋白有118個，其中上調蛋白81個，下調蛋白37個。(5)利用表達良好的轉基因細胞系為核供體生產24枚克隆胚胎，移植受體母畜12頭，有2頭妊娠。其中1頭發(fā)育到期并生