水稻、玉米籽粒淀粉合成相關酶基因的分子調控研究.pdf

1、淀粉是水稻、玉米等農作物籽粒中最主要的成分。根據其結構可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。高支鏈、低直鏈的淀粉主要用于食品業(yè)，而高直鏈、低支鏈的淀粉在醫(yī)療、紡織、環(huán)保等多個領域有著更為廣闊的市場前景，需求量巨大，但目前適合于特定用途的淀粉種質卻極為缺乏，因此利用分子生物學的手段調控作物籽粒淀粉的合成，獲得新型種質具有重要意義。淀粉是在一系列酶的作用下合成的，其中顆粒結合型淀粉合成酶Ⅰ（Granule-bound starch synthaseⅠ，

2、GBSSⅠ或Waxy）直接催化直鏈淀粉的合成，淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）的一個同工型酶SBE3被認為在形成支鏈淀粉過程中起到關鍵的作用。而蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）則是生物糖代謝的關鍵酶之一。因此，調控這些淀粉合成相關酶基因就有可能改變作物籽粒淀粉的組成，獲得淀粉品質更為優(yōu)良的新型種質資源。為此，本實驗以水稻和玉米為實驗材料，采用過量表達和RNAi技術，分別

3、對Waxy基因，SBE3基因，MDH基因進行了分子調控的研究。獲得了如下主要結果：
　　 1．在農桿菌介導下將SBE3基因RNA干擾表達載體轉化水稻中花11，獲得了41株轉基因株，半定量RT-PCR檢測表明SBE3基因的表達量明顯降低。T1代農藝性狀初步檢測顯示胚乳直鏈淀粉含量顯著升高，而千粒重卻顯著降低。進一步對其T2代部分純系追蹤檢測發(fā)現，直鏈淀粉含量均顯著高于未轉化水稻，單株最高達38.4％，提高了166.5％，而轉化植株

4、的有效穗粒數及千粒重均顯著降低。
　　 2．RNA干擾SBE3基因T3代2個轉基因株系的各淀粉合成關鍵酶酶活的檢測發(fā)現，轉基因株系SBE酶活性在籽粒發(fā)育各時期均顯著降低并提前3d達高峰期，且不同株系間具有差異。該基因酶活的下降也使籽粒發(fā)育不同時期的ADPG-PPase和SSS及DBE的酶活均不同程度的顯著降低。千粒重與直鏈淀粉含量檢測顯示，千粒重顯著低于未轉化植株，且大致的趨勢是直鏈淀粉含量越高，千粒重越小。這表明在淀粉的合成過

5、程中各關鍵酶不是孤立的發(fā)揮作用的，彼此間相互影響。SBE酶活的降低同時導致淀粉合成若干關鍵酶活性下降可能是轉基因株系千粒重顯著下降的一個重要原因。
　　 3．農桿菌介導的水稻全光照快速遺傳轉化體系，以粳稻中花11號為受體材料，將構建的水稻Waxy基因過量表達載體導入受體中花11，獲得了39株PCR檢測為陽性的轉基因植株。建立了轉基因植株拷貝數實時熒光定量PCR快速檢測體系。利用該體系檢測結果發(fā)現其中25株為單拷貝轉基因植株。半定

6、量RT-PCR檢測發(fā)現，T0代植株部分籽粒中Waxy基因的表達量明顯升高，且植株間存在差異。
　　 4． Waxy基因過量表達轉基因水稻T0代農藝性狀的檢測顯示，與對照中花11相比，轉基因水稻千粒重、株高、穗長，分蘗數及單穗實粒數都未能發(fā)生顯著變化，但T1種子糙米籽粒顏色變暗，透明度明顯降低，籽粒皺縮。直鏈淀粉百分含量測定顯示，轉基因水稻大部分植株的胚乳直鏈淀粉含量顯著提高，平均提高了42.72％，從未轉化水稻的14.28％，提

7、高到了20.38％，最高單株提高到29.18％，提高了104.3％。
　　 5．從玉米X178品種的葉片中克隆出了cyMDH基因，其全長為1264bp。通過生物信息學分析發(fā)現，該序列中包含1個70bp5’非翻譯區(qū)，1個195bp3’非翻譯區(qū)以及1個完整的開放閱讀框，該閱讀框從起始密碼子ATG到終止子TGA共記999bp，共編碼332個氨基酸（GenBank登陸號HU625276）。依據這個序列信息成功構建了玉米cyMDH基因的R

8、NA干擾表達載體。
　　 6．通過對影響農桿菌介導玉米轉化的各種因素的比較研究，確立了農桿菌菌液濃度OD600值為0.7，AS濃度為100μmol/L，浸染時間為15min為適宜的轉化條件。初步建立了玉米cyMDH基因RNAi遺傳轉化體系。應用該體系進行遺傳轉化獲得了5株PCR陽性轉基因株。
　　 綜上所述，本研究利用轉基因技術分別對水稻籽粒淀粉合成關鍵酶Waxy基因和SBE3基因進行過量表達和RNAi分子調控，獲得了籽