東方山羊豆抗逆相關轉錄因子基因的克隆和相關研究.pdf

1、東方山羊豆（Galega． orientalis L．）為豆科山羊豆屬植物，是一種優(yōu)質的飼用牧草。東方山羊豆產草量高，利用年限長，抗逆、抗病性強，適口性好，具有促進奶牛產奶量和乳脂率的提高等功能，適宜建植人工草地與改良天然草地，在我國“退耕還草、退牧還草、草田輪作”中應用前景將十分廣闊，對東方山羊豆這些特性的深入研究和開發(fā)利用具有非常重要的經濟與生態(tài)意義。為了探討東方山羊豆應答環(huán)境脅迫的分子機制，本論文開展了抗逆轉錄因子相關基因的分離、

2、克隆以及表達特性分析，并通過轉基因技術獲得轉基因植株，為探討和改良牧草對非生物脅迫的耐性提供了理論依據(jù)和技術保障。目前，取得如下的研究進展： 一、分離了1個冷誘導的東方山羊豆ERF轉錄因子基因GoDREB全長序列，初步明確了其特性及功能。 1．采用RACE的克隆方法，從東方山羊豆中克隆到一個ERF類轉錄因子，將其命名為GoDREB?；蛐蛄蠴RF區(qū)為1095bp，編碼一個由364個氨基酸組成的蛋白。序列分析表明：GoDR

3、EB基因中具有一個內含子，長度為1332 bp，在ORF的第255個核苷酸（T）與第256個核苷酸（A）之間； GoDREB基因具有ERF轉錄因子所特有的核定位信號、DNA結合域以及轉錄激活域；它與其他已知的ERF基因除了在保守的AP2/EREBP結構域處具有很高的同源性外，在其它的區(qū)域同源性也較高。GoDREB具有植物ERF轉錄因子典型的結構特征，是植物ERF轉錄因子家族的一個新成員，屬于該轉錄因子家族的classⅣ亞族。 2

4、．采用實時熒光定量PCR的方法，對東方山羊豆逆境脅迫下的表達特性進行分析。實驗結果表明GoDREB在東方山羊豆中的轉錄表達不僅受低溫、PEG和鹽誘導，而且也受外源激素MeJA和SA的誘導；其中，受低溫誘導的變化明顯早于PEG和鹽誘導，而對ABA的誘導幾乎沒有響應，由此推測GoDREB可能主要通過SA/JA途徑參與對逆境的早期防衛(wèi)反應，而不依賴于ABA途徑。運用半定量RT-PCR方法，分析了GoDREB基因在東方山羊豆不同組織中的表達特異

5、性，結果表明：東方山羊豆GoDREB基因在三種組織中的表達存在差異，相比而言在葉中的表達最強，在莖中的表達較弱，而在根中的表達量為最弱。GoDREB基因在各個器官都具有一定的表達量說明它本身是一個組成型表達的基因。 3．通過分子分析證明GoDREB是定位在細胞核。亞細胞定位結果表明，pCAMBIA1302-GoDREB-GFP融合蛋白集中分布在細胞核中，而對照pCAMBIA1302在細胞核和細胞質中均有分布，證明了GoDREB具

6、有核定位的特性。 4．獲得了轉GoDREB基因煙草植株。通過農桿菌介導法將GoDREB轉入煙草中，對轉基因煙草T0代植株進行PCR檢測和RT-PCR鑒定。結果表明，GoDREB基因已經整合到煙草基因組中，并可在轉錄水平正常表達。 二、分離到1個冷誘導的東方山羊豆RAV轉錄因子基因GoRAV全長序列，初步明確了其特性及功能。 1．通過RT-PCR和RACE方法，分離到1個冷誘導的東方山羊豆RAV轉錄因子編碼基因Go

7、RAV，ORF區(qū)為1164bp，編碼由387個氨基酸殘基組成的RAV轉錄因子GoRAV。通過分析GoRAV基因的結構，證明在該基因內部沒有內含子。序列比對分析表明，GoRAV是RAV轉錄因子家族的一個新成員。GoRAV與豆科植物大豆GmRAV的一致性最高，與雙子葉植物的RAV具有相對較高的同源性，而與單子葉植物的序列一致性略低。 2．通過實時熒光定量PCR分析了GoRAV在逆境脅迫下的表達特性。實驗結果表明GoRAV基因在東方山

8、羊豆中能夠被PEG和低溫、以及外源植物激素ABA、SA和MeJA誘導，初步推測GoRAV可能通過ABA/MeJA信號傳導途徑參與東方山羊豆對逆境的防御反應。半定量RT-PCR方法分析GoRAV基因在東方山羊豆不同組織中的表達特異性，結果表明：GoRAV基因在三種組織中的表達存在差異，在根中不表達，在莖和葉中均有較強的表達。 3．通過分子分析證明GoRAV是定位在細胞核。亞細胞定位結果表明，pCAMBIA1302-GoRAV-GF