小菜蛾APN和Pxbre基因的克隆與mRNA表達.pdf

1、小菜蛾（Plutellaxylostella L.）的生殖周期短、繁殖量大、適應性廣，是世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲，也是產(chǎn)生抗藥性最嚴重的害蟲之一。蘇云金桿菌Bacillusthuringiensis（Bt）內(nèi)毒素是一種殺蟲特異性高、對脊椎動物安全的殺蟲蛋白，廣泛用于對小菜蛾的防治。由于其長期使用，已經(jīng)在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)了小菜蛾對Bt制劑產(chǎn)生了嚴重抗性。為了使這一環(huán)境友好型殺蟲劑能長期使用，有必要研究清楚其抗性機理。目前對小菜蛾抗性機理已經(jīng)在

2、生化和分子水平上做了一些基礎(chǔ)研究，但沒有明確的結(jié)論。本文對可能與抗性相關(guān)的小菜蛾4個Pxbre新基因進行了克隆，并比較了APN，ALP及bre2-1ike等15個基因在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系中的mRNA表達水平。
　　 1.小菜蛾9個APN基因和1個ALP基因mRNA表達水平的比較
　　 昆蟲中腸氨肽酶APN和堿性磷酸酯酶ALP表達量可能與Bt毒素抗性相關(guān)。本研究利用半定量PCR比較了9個氨肽酶APN基因和1個

3、堿性磷酸酯酶ALP基因在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系四齡幼蟲中腸間的mRNA相對表達量，發(fā)現(xiàn)它們之間沒有顯著差異。推測小菜蛾對CrylAc毒素的抗性可能與這幾個基因的mRNA表達量無關(guān)。
　　 2.小菜蛾P(guān)xbre基因的克隆、序列分析和在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系中mRNA表達水平的比較
　　 在線蟲中，Bt毒素與中腸BBMV上糖脂受體結(jié)合后導致孔洞的形成、線蟲的死亡；在昆蟲中也有證據(jù)表明Bt毒素能與糖脂受體結(jié)

4、合。根據(jù)線蟲中4個bre基因及其同源基因的保守序列設(shè)計簡并引物，利用RT-PCR擴增出小菜蛾中與線蟲bre基因同源的cDNA片段，再用RACE技術(shù)獲得了4個基因的全長cDNA，分別命名為Pxbre-1、Pxbre-3、Pxbre-4、Pxbre-5。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，這些基因和線蟲中相應的基因序列具有較高的相似性，且具有相同的氨基酸保守模塊，推測所克隆的基因和對應的線蟲bre基因有著類似的功能。
　　 比較小菜蛾CrylAc抗性

5、、敏感品系4個Pxbre基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩個品系間存在多個氨基酸多態(tài)性位點，但是在抗性品系中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的氨基酸替換。在抗性品系中發(fā)現(xiàn)Pxbre-3基因的一個克隆中存在一個插入突變，經(jīng)過與基因組序列比對，表明該插入序列是由于該段中的內(nèi)含子未被剪切。該插入突變可以導致氨基酸翻譯被提前終止，但該突變是否與抗性有關(guān)需要進一步研究。
　　 通過定量PCR技術(shù)檢測了5個Pxbre基因在小菜蛾四齡幼蟲、蛹、成蟲中的mRNA相對表達量