中東呼吸綜合征冠狀病毒merscov實驗室檢測2015

1、中東呼吸綜合征冠狀病毒實驗室檢測,王文玲中國疾病預防控制中心病毒病所應急技術中心2015年6月9日,參考標準,中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實驗室檢測技術指南WHO: Laboratory Testing for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus：interim recommendations (revised) . (S

2、eptember 2014  ）US CDC：Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Patients Under Investigation (PUIs) for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) - Versio

3、n 2,MERS-CoV感染標本采集對象,中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進一步研究的確診病例；其它需要進行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。,標本采集要求,從事MERS-CoV檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓，培訓合格且具備相應的實驗技能。在標本采集過程中，采樣人員進行安全防護。住院病例的標本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員在當地疾控機構專業(yè)人員指導下采集。密切接觸者標本由當地疾控機構負責采集。根據實驗室檢

4、測工作的需要，結合病程再次采樣。,采集標本種類和要求,呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿液和糞便）、尸檢標本。每個病例應盡可能同時采集上、下呼吸道標本，下呼吸道標本最佳，建議同時采集糞便和尿液標本。應盡可能采取發(fā)病初期和恢復期雙份血清標本以確定是否感染，雙份血清樣品間隔14~21天采集比較理想，第一份血清應在發(fā)病第一周內采集。但單份樣品的檢測對于確定疑似病例也有價值，如果只能采集一份樣品，應該在出現癥狀后至少14天采集。,標

5、本的保存,樣品采集后應盡快送至實驗室，運輸過程需合理。若呼吸道樣品72小時以上才能到達實驗室，強烈推薦將樣品儲存在-80℃并使用干冰進行運輸，應避免樣品反復凍融。從全血分離的血清應4℃儲存并運輸，或用干冰、液氮冷凍并運輸。由于無霜冰柜溫度波動較大，應避免使用無霜冰柜儲存呼吸道和血清樣品。,院內轉運時，標本應該放置在耐用、防滲透的二級容器中進行轉運。為減少任何標本破、漏的風險，不要使用任何氣動傳輸系統(tǒng)來轉運任何可能疑似患者標本。轉運

6、至CDC的MERS-CoV標本應該充分包裹，轉運時不能開蓋或分裝標本。標本轉運應該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內層是主要的容器（一個可密封的標本袋纏繞以可吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉運的包裝。,MERS-CoV感染標本包裝和運輸,,MERS-CoV感染實驗室檢測方法,核酸檢測：為目前早期診斷、早期發(fā)現MERS-CoV感染病例的主要檢測方法，采用Real-time PCR 進行病毒核酸檢測和診斷，患者呼吸道樣本中擴增到特

7、異性核酸，可確診MERS-CoV感染 。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列?？乖贵w檢測:IgM捕獲法ELISA檢測血清特異性IgM抗體間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體利用假病毒進行中和抗體檢測,MERS-CoV的實驗室檢測靶標,目前病毒核酸的檢測方法主要有：檢測E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a 、 N2基因四種。這些方法均高度敏感，推薦upE檢測用于初篩;檢測ORF1b基

8、因的方法不如針對ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測具有較高的靈敏性。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個適合測序驗證的靶序列。,,巢式PCR,普通PCR,PCR產物電泳或測序,逆轉錄，獲得cDNA,核酸提取,標本采集,,PCR檢測,,,,,,,,,,熒光定量PCR,實驗方案,待檢樣品,upE 特異性RT-PCR檢測,陽性,陰性,ORF1a RT

9、-PCR檢測,陽性,陰性,確 診,RdRp測序或N 測序,陰性,抗原檢測抗體檢測病毒分離,陽性,實驗流程,,upEupE-Fwd 5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'upE-Rev 5'-GCCTCTACACGGGACCCATA-3'upE-Prb 5'FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAG

10、CTCG-TAMRA 3'ORF1bORF1b-Fwd 5'-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3'ORF1b-Rev 5'-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3'ORF1b-Prb 5'FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3'ORF1aORF1a-Fwd 5

11、9;- CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3'ORF1a-Rev 5'- CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3'ORF1a-Prb 5'FAM- TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3'N2N2-Fwd 5'- GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3'N2

12、-Rev 5'- TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3'N2-Prb 5'FAM- ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3',分子檢測引物與探針,Y=-3.56x+39.19R2=0.988,1e6 1e4 1e3 1e2,熒光定量RT-PCR檢測結果判斷,陰性: 無Ct值或Ct為40。陽性：

13、Ct值<37, 可報告為陽性。Ct值在37-40之間的樣本建議重做, 若重做結果Ct值< 37，該樣本判斷為陽性, 否則為陰性。,MERS-CoV核酸檢測結果報告,在實驗室要確認一個樣本為陽性，需要滿足以下兩個條件的其中一個：至少兩種MERS-CoV特異性PCR結果陽性；一種PCR結果為陽性，另外一種PCR產物序列測序，與MERS-CoV序列相符。當針對MERS-CoV的兩種不同的檢測方法結果不一致的時候，應當采用反

14、轉錄PCR擴增，對擴增產物進行測序以確認檢測結果。,檢測結果判讀,陰性結果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產生假陰性，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異，PCR抑制等。當PCR檢測結果為陰性，但臨床表現和流行病學特點提示是MERS-CoV感染時，可采用血清學方法進行檢測。雙份血清標本能夠滿足血清學檢測的要求。,我國首例輸入性

15、中東呼吸綜合征病例的實驗室快速確診,2015年5月27日晚10時世界衛(wèi)生組織向中國衛(wèi)生計生委通報，韓國1例確診中東呼吸綜合征（MERS）病例的密切接觸者經香港入境廣東省惠州市。5月28日下午，經廣東省疾控中心對病例標本進行核酸檢測，初篩結果為陽性。樣本接收時間：2015.5.29日凌晨1點40分（中國疾控中心病毒病所）實驗室確診結果上報： 2015.5.29日凌晨5點40分,疑似MERS-CoV感染的實驗室快速確診,樣本來源：K

16、IM MYEONGSHIK (韓國）廣東省惠州市樣本類型：鼻咽拭子(3份） 血清(1份）采樣日期：2015.5.28實驗室復核檢測流程：BSL-3實驗室：分裝滅活 BSL-2實驗室：核酸提取 熒光定量RT-PCR (三個靶標UpE、ORF1b和N2) 結果判定與報告,廣東省CDC疑似MERS-CoV感染的復核檢測,UpE檢測擴增曲

17、線,ORF1b檢測擴增曲線,N2檢測擴增曲線,疑似MERS-CoV感染的送檢樣本復核檢測,熒光定量RT-PCR檢測結果（Ct 值）,結論,采用upE/ORF1b/N2 三個靶標，進行三種熒光定量RT-PCR擴增，在對照成立的基礎上，三管咽拭子樣本檢測結果皆為陽性?；贜2靶標的熒光定量RT-PCR擴增，血清標本呈弱陽性。結論：廣東疑似MERS-CoV病人實驗室檢測確定為MERS-CoV感染陽性。,上海輝瑞合作研發(fā)試劑盒（單管雙靶標）

18、應用驗證,MERS-CoV RNA雙色檢測試劑盒ORF1b/upE （FAM/VIC）,基于濁度儀和羥基萘酚藍顏色變化的簡單快速和靈敏的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術,RT-LAMP檢測方法的特異性濁度圖和顯色圖,特異性高，檢測下限分別為每管反應500與1000拷貝，有望應用于MERS-CoV感染的快速篩選，具有在基層醫(yī)療衛(wèi)生機構和現場推廣和應用的潛力,RT-PCR擴增RdRp或N基因后測序檢測MERS-CoV,RdRpSeq assay:

19、EMC-SeqRdRP-Rev: GCA TWG CNC WGT CAC ACT TAG GEMC-SeqRdRP-Fwd: TGC TAT WAG TGC TAA GAA TAG RGCEMC-SeqRdRP-Rnest: CAC TTA GGR TAR TCC CAW CCC AW=A/T, N=A/C/T/G, R=A/GFragment size: first round : 242bp (including prime

20、rs),second round 228 bp (including primers)Nseq assay:EMC-SeqN-Fwd: CCT TCG GTA CAG TGG AGC CAEMC-SeqN-Rev: GAT GGG GTT GCC AAA CAC AAA CEMC-SeqN-Fnest: TGA CCC AAA GAA TCC CAA CTA CFragment size: first round : 30

21、6-312 bp (including primers),second round 279-285 bp (including primers)Reference:Corman/Müller et al.; Eurosurveillance, Volume 17, Issue 49, 06 December 2012,通用引物檢測冠狀病毒,冠狀病毒通用引物RT-PCR擴增產物電泳,One-step RT-PCR ass

22、ays (OneStep RT-PCR kit； QIAGEN) 反應條件：1. 反轉錄: 50℃ for 30min 2. PCR擴增: 95 ℃ for 15 min (激活)，50 cycles (30 sec at 94 ℃；30 sec at 48 ℃；1min at 72 ℃ )，最后延伸 72 ℃ for 10min。,引物對序列：Cor-FW (5'-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-

23、3') Cor-RV (5'-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3‘),IFA抗原片檢測MERS-CoV特異抗體,中和抗體檢測,利用MERS-CoV假病毒體系進行中和抗體檢測，實驗操作簡單而不受BSL-3實驗室的限制（Virology Journal.2013;10(1):266)。,中國CDC目前實驗室檢測相關技術儲備與培訓,已引進MERS-CoV 病毒毒株；建立分子檢測技術，形成SOP，成功完成了廣東M