三角帆蚌創(chuàng)傷修復(fù)模型的構(gòu)建及重組TIMP的抑制功能研究.pdf

1、我國(guó)貝類養(yǎng)殖中，三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是重要的雙殼貝類之一，育珠插核過程中傷口容易受到病原體侵染，使育珠蚌的吐核率升高，甚至造成蚌的死亡。因此，開展對(duì)其分子免疫及傷口修復(fù)機(jī)制的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　本實(shí)驗(yàn)采用RACE PCR技術(shù)克隆出了三角帆蚌2種金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP1、TIMP2）的cDNA序列，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)2種基因在健康蚌鰓、外套膜、閉殼肌、血淋巴、肝胰臟5種

2、組織中的表達(dá)情況；以及嗜水氣單胞菌和肽聚糖（PGN）刺激后，2種基因在血液和肝胰臟中的表達(dá)變化；通過建立創(chuàng)傷修復(fù)模型，利用RT-PCR方法檢測(cè)2種基因在傷口修復(fù)期間各時(shí)間段的表達(dá)情況；利用原核表達(dá)技術(shù)對(duì)2種基因進(jìn)行了原核表達(dá)，檢測(cè)了重組蛋白對(duì)金屬蛋白酶的抑制活性。
　　TIMP1基因的cDNA全長(zhǎng)序列為1160 bp，其中5’UTR（非編碼區(qū)）有40bp；3’UTR有412bp；開放閱讀框（ORF）的堿基長(zhǎng)度為708bp，由235

3、個(gè)氨基酸組成。經(jīng)Expasy在線網(wǎng)站的SignalP4.0分析氨基酸發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號(hào)肽序列，該蛋白理論分子量為27.26kDa，等電點(diǎn)為8.89，帶負(fù)電荷殘基的總數(shù)（Asp+Glu）有26個(gè)，帶正電荷的殘基的總數(shù)（Arg+Lys）有35個(gè)?？寺〉玫降腡IMP2基因序列長(zhǎng)度729bp，其中5’UTR38bp，3’UTR長(zhǎng)度為238bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為453bp，共編碼150氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號(hào)肽序列。推導(dǎo)的蛋白分子量為16

4、.58kDa，等電點(diǎn)為8.72。帶負(fù)電荷殘基的總數(shù)（Asp+Glu）為11，帶正電荷的殘基的總數(shù)（Arg+Lys）為15。
　　TIMP1,2基因的mRNA在健康蚌的血液、外套膜、肌肉、鰓和肝胰腺中均有表達(dá)。其中，TIMP1在血液中表達(dá)量最高，外套膜中最少。TIMP2在肌肉中表達(dá)量最高，其次是血液。嗜水氣單胞菌刺激后，TIMP1在24h的血液中表達(dá)量極顯著性上升，肝胰臟中表達(dá)無(wú)明顯變化；TIMP1在PGN刺激后6h的血液中極顯著性

5、上調(diào)，在肝胰臟中表達(dá)量無(wú)顯著變化。TIMP2經(jīng)PGN和嗜水氣單胞菌刺激后在肝臟中表達(dá)量變化不明顯，經(jīng)PGN刺激后在血液中表達(dá)量上調(diào)，在48h表達(dá)量最高。嗜水氣單胞菌刺激在血液中呈上調(diào)趨勢(shì)，3h表達(dá)量最高。
　　TIMP1,2基因在創(chuàng)傷后的第1d表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的增加，2種基因的都具有降低趨勢(shì)的表達(dá)量，到達(dá)第15d時(shí)恢復(fù)到初始水平。
　　將三角帆蚌TIMP1,2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-32a利用ECORI、Hind