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1、Notch信號(hào)在大鼠胎肺信號(hào)在大鼠胎肺AECⅡ細(xì)胞轉(zhuǎn)分化分化調(diào)控機(jī)制中作用的研控機(jī)制中作用的研究（一）（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（40008000字）：1.項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)近年來(lái)，我國(guó)早產(chǎn)兒出生率從1985年的9.8％上升至目前的12％，即每年約有450萬(wàn)例早產(chǎn)兒出生[1]。早產(chǎn)兒尤其是極低出生體重兒肺損傷已成為新生兒死亡、致殘的主要原因之一，重度肺損傷病死率仍在40%以上[2]。迄今早產(chǎn)兒肺損傷發(fā)病機(jī)制尚未

2、完全闡明，臨床亦無(wú)有效治療措施，給家庭及社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。因此，深入研究早產(chǎn)兒肺損傷的發(fā)生機(jī)制和防治措施，對(duì)提高早產(chǎn)兒存活率和生存質(zhì)量具有重要意義。肺發(fā)育受阻及不成熟肺組織異常修復(fù)是早產(chǎn)兒肺損傷的兩個(gè)特征性病理改變[3]。晚近研究表明，炎性因子、氧中毒、氣壓或容量損傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏等病因致單核巨噬細(xì)胞高度活化，導(dǎo)致腫瘤壞死因子（TNF）、IL8、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等諸多細(xì)胞因子水平異常升高。這些細(xì)胞因子構(gòu)成調(diào)

3、節(jié)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)正反饋機(jī)制進(jìn)一步促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞，介導(dǎo)肺損傷發(fā)生。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolarepithelialcellⅡAECⅡ)是肺內(nèi)主要干細(xì)胞，肺損傷修復(fù)的唯一途徑是AECⅡ增殖并向肺泡Ｉ型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation），對(duì)肺泡壁重新上皮化以恢復(fù)氣血屏障起重要作用。在早產(chǎn)兒肺損傷中，AECⅡ轉(zhuǎn)分化轉(zhuǎn)分化居于肺發(fā)育受阻及損傷修復(fù)的中心位置[4]。目前，有關(guān)AECⅡ轉(zhuǎn)分化的研究在國(guó)內(nèi)外受到高度

4、重視，但多以成年肺泡上皮為研究對(duì)象，對(duì)發(fā)育中胎肺Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化研究甚少。研究表明，AECⅡ能轉(zhuǎn)分化為AECＩ，后者可逆轉(zhuǎn)為AECⅡ，這種轉(zhuǎn)分化主要受肺成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）調(diào)節(jié)，AECⅡ和基底膜細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用貫穿于整個(gè)修復(fù)過(guò)程[3]。正常肺組織的超微結(jié)構(gòu)研究證實(shí)，AECⅡ通過(guò)“上皮足突”穿越基底膜與肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞相聯(lián)系。當(dāng)AECⅡ處于分裂增殖狀態(tài)時(shí)，上皮突起數(shù)目減少，上皮下基底膜完整；而當(dāng)AECⅡ轉(zhuǎn)分化時(shí)，上皮突起

5、則增多，基底膜變得不完整。而且AECⅡ增殖的同時(shí)，與之聯(lián)系的間質(zhì)成纖維細(xì)胞亦增殖。DemayoF[3]等推測(cè)，AECⅡ與肺成纖維細(xì)胞的直接接觸可能是調(diào)控肺上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的重要前提。若AECⅡ正常轉(zhuǎn)分化轉(zhuǎn)分化為AECＩ，則損傷完全修復(fù)，肺結(jié)構(gòu)正常；若AECⅡ轉(zhuǎn)分化異常，則導(dǎo)致不成熟肺異常修復(fù)和肺發(fā)育阻滯。目前，關(guān)于AECⅡAECＩ間可逆轉(zhuǎn)分化的研究?jī)H限于離體實(shí)驗(yàn)，在早產(chǎn)兒肺損傷中的作用尚不清楚。因此，研究Ⅱ型細(xì)胞“轉(zhuǎn)分化”及基質(zhì)對(duì)其調(diào)

6、控機(jī)制，是闡明早產(chǎn)兒肺損傷發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵所在。細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控Ⅱ型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的信號(hào)途徑成為關(guān)注的焦點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)，Notch受配體信號(hào)系統(tǒng)可決定肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化方向，從而在肺發(fā)育及肺損傷修復(fù)中起重要作用[5]。Notch信號(hào)為一組高度保守的跨膜蛋白質(zhì)，由Notch1～4、配體（Delta、Jagged）及目的基因supperssofhairless(Su(H))、Hes（hairyenhanceofsplit）組成，是多種組織和器官早期發(fā)

7、育所必需的細(xì)胞間調(diào)節(jié)信號(hào)，通過(guò)鄰近細(xì)胞間相互作用精確調(diào)控各譜系細(xì)胞（如多種器官干細(xì)胞及其原始細(xì)胞）的發(fā)育、增殖、分化。研究表明[6]，Notch配體通過(guò)與相鄰的色及電子顯微鏡技術(shù)）色及電子顯微鏡技術(shù)）；2.兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化狀況的差異（利用流式細(xì)胞技術(shù)）兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化狀況的差異（利用流式細(xì)胞技術(shù)）；3.胎肺胎肺AECⅡ和成纖維細(xì)胞表面和成纖維細(xì)胞表面Notch受配體表達(dá)狀況（利用共聚焦顯微鏡技術(shù)）配體表達(dá)狀況

8、（利用共聚焦顯微鏡技術(shù)）；4.兩種培養(yǎng)條件下兩種培養(yǎng)條件下AECⅡ細(xì)胞細(xì)胞Notch受配體表達(dá)的差異（利用基因表達(dá)連續(xù)分析技配體表達(dá)的差異（利用基因表達(dá)連續(xù)分析技術(shù)，術(shù)，SAGE）；5.研究生理抑制劑，阻斷細(xì)胞膜表面研究生理抑制劑，阻斷細(xì)胞膜表面Notch受體對(duì)胎肺受體對(duì)胎肺AECⅡ增殖、分化的影響；增殖、分化的影響；6.建立早產(chǎn)鼠慢性高氧肺損傷動(dòng)物模型，研究高濃度氧對(duì)早產(chǎn)動(dòng)物肺損傷形態(tài)學(xué)及建立早產(chǎn)鼠慢性高氧肺損傷動(dòng)物模型，研究高濃度氧